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脂肪酶 生物催化过程 1 一 脂肪酶的概述 脂肪酶的定义脂肪酶 lipase 又称甘油酯水解酶 是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶 脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶 只作用于异相系统 即只在油水界面上作用 而且只有当底物以微粒 小聚合分散状态或呈乳化颗粒时 脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用 2 脂肪酶催化的反应 3 二 脂肪酶的来源 脂肪酶广泛存在动物 植物和微生物中而微生物脂肪酶种类最多 广泛存在于细菌 酵母和霉菌中 最易获得和大规模生产 且具有比动植物脂肪酶更广的pH 温度适应性 因此是工业用脂肪酶的重要来源 细菌脂肪酶细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵 生产比较容易 细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶 且在pH4 11 温度30 60 间具有良好的稳定性 假单胞菌属的细菌脂肪酶应用最为广泛 4 真菌脂肪酶真菌脂肪酶具有温度和pH稳定性 底物特异性以及在有机溶剂中具有高活性 且提取成本比较低等优点 因而发展迅速 商业化的真菌脂肪酶主要有 黑曲霉 米曲霉等 5 三 脂肪酶的催化机理 脂肪酶的活性中心是丝氨酸 Ser 残基 Ser与天冬氨酸 Asp 组氨酸 His 组成的三元组催化中心 正常情况下 该中心埋在一个或数个 螺旋结构的 盖子 下面 受 螺旋的保护 盖子 的疏水集团与这个三元组的疏水区域相结合 这个带有色氨酸 Trp 的盖子具有两亲性 Trp疏水表面与催化中心的疏水区域相结合 暴露出的另一端则面向外 与水分子以氢键连接 此时脂肪酶处于非活性构象 当脂肪酶与界面相接触时 覆盖活性位点的螺旋结构打开 暴露疏水残基增加与脂类底物的亲和力 暴露活性位点 同时该变化导致脂肪酶在Ser周围产生一个亲电区域 可保护催化过程中过度中间产物稳定 脂肪酶处于活性中心 6 分光光度法 荧光测定法 酸碱滴定法 浊度滴定法 甘油测定法 色谱分析法 脂肪酶的测定方法 方法 简单易懂 准确性好 7 四脂肪酶的生产方法 8 产脂肪酶菌株的筛选1筛选路线采样 富集培养 初筛 复筛 检测酶活 鉴定菌种 保藏菌种2初筛方法 可淘汰85 一90 不符合要求的微生物利用平皿的生化反应进行分离 RhodamineB平板筛选法筛选原理 脂肪在脂肪酶的催化作用下水解生成甘油和脂肪酸 脂肪酸能与RhodamineB的阳离子发生作用 生成黄色的荧光物质 所以用紫外灯的观察 产脂肪酶的菌株周围会出现荧光圈 依据荧光圈的大小进行菌种的筛选 9 溴甲酚紫平板筛选法筛选原理 溴甲酚紫作为一种显色剂 其pH变色为5 2 6 8 在碱性条件下显紫色 在酸性条件下显黄色 脂肪在脂肪酶的催化作用下生成的脂肪酸会使培养基的pH降低 产脂肪酶菌株的周围会出现黄色的透明圈 根据透明圈的有无和大小来筛选产脂肪酶的菌株 透明圈越大说明产脂肪酶活力越强 10 琼脂块培养法将分离培养基用灭菌的打孔器制作成许多单个的直径约0 6cm的小琼脂块 排放在干净的培养皿内 将挑选的菌株接种在这些小琼脂块上培养 让其充分生长 然后依次再将长满菌的小琼脂块放到酶活测定板上 28 培养1 3d 观察各菌落周围油脂水解圈的大小 水解圈越大 酶活越强 将水解圈大的菌株纯化后保存在斜面培养基上 11 五蜡脂的生产过程 利用固定化脂肪酶酶膜 使用价格低廉的大豆油为原料 在无溶剂体系中催化大豆油和十六醇转酯化反应合成不饱和的蜡脂 12 六影响蜡脂产率的因素 1固定化酶用量对产率的影响随固定化酶用量增加 反应产率也逐渐增加到一个极致保持稳定 13 2底物摩尔比对产率的影响蜡脂的产率随醇油摩尔比的增加而增加达到一个最高值 当十六醇继续增加时蜡脂的产率开始下降 分析主要是十六醇在反应中的底物抑制作用导致的 14 3水添加量对产率的影响水少或水多都会影响产率 15 4搅拌转速对产率的影响转速过低过高都会影响蜡脂产率 16 5酶和十六醇流加对产率的影响分批流加酶和十六醇可以增加产率 17 六 脂肪酶的应用 1食品工业脂肪酶在食品工业中用于改善甘油三酯的结构 从而使其物理性质发生变化 用于开发一系列的功能性和营养性油脂食品 三酰甘油的水解脂肪酶酶促水解三酰甘油法可为食品工业提供优质的原料 短链脂肪酸还可以改善食品的风味和香味 比较三酰甘油的常规水解方法和酶水解方法 18 三酰甘油的改性 酯交换反应 脂肪酶催化油脂改性 由一种甘油酯生成另一种甘油酯 作用 改善食用油的质量开发食用油的品种提高食用油的营养价值RCOOR R COORRCOOR R COOR 19 2洗涤工业3合成精细化学产品用脂肪酶在有机溶剂中催化合成羧酸酯系列香精酯 萜烯醇酯 中长链脂肪酸短链醇酯及长链脂肪酸长链脂肪醇酯等系列产品 4拆分消旋混合物脂肪酶对手性化合物如醇 羧酸 酯 酰胺和胺等均有较好的立体选择性 因此脂肪酶被广泛地用来拆分外消旋醇和羧酸 拆分的主要途径为立体选择性水解 酯化或转酯