试验分析方法.doc

试验分析方法伊灵燕一、取样时期：齐口花时采样。二、测定指标（每处理茎/叶各称： 12个0.5g；4个1g；8个2g。叶绿素另取）：（一）形态指标1、株高：用直尺测量2、茎粗（最粗处）：用游标卡尺测量3、节间长：株高/节数4、叶长、叶宽、叶柄长：用直尺测量5、植株鲜、干重：分为整株、根、地上部、菜薹重和叶重（包括叶片和叶柄）6、比叶重：用打孔器，每个重复打20个圆片，烘干，称干重（二）叶片色素：参照张宪政（1986）的方法，（三）品质指标：分为叶片和菜薹1、硝酸盐：比色法（李和生，2000）。2、抗坏血酸（VC）含量：比色法，李合生（2000）3、可溶性糖：蒽酮比色法（李和生，2000）。4、可溶性蛋白: 考马斯量兰比色法（李和生，2000）。5、游离氨基酸：茚三酮显色法，李合生（2002）6、类黄酮、可溶性酚：比色法7、纤维素（薹干样0.2g）：四、指标测定方法：1. 叶绿素参照张宪政（1986）的方法，菜心叶片鲜样0.5g浸泡在25ml丙酮/无水乙醇（1:1，V:V）溶液中，至叶片发白。测定OD645、OD663和OD440。叶绿素a浓度（mg/L）12.7OD6632.69OD645叶绿素b浓度（mg/L）22.9OD6454.86OD663总叶绿素浓度（mg/L）8.02OD663+20.20OD645类胡萝卜素浓度（mg/L）4.7 OD4400.27总叶绿素浓度叶绿体色素的含量（mg/g）（ 色素浓度提取液体积）/样品鲜重2. 硝酸盐 比色法 李和生（2000） （1）500g/ml硝态氮（NO3-）标准液：精确称取烘干至恒重KNO3 0.7221 g（0.8145g）溶于去离子水中，定容至200ml（100ml）。（2）5%水杨酸-硫酸溶液：称取5g水杨酸溶于100ml浓硫酸中，搅拌溶解后，贮于棕色瓶中，置冰箱中保存1周有效。（3）8%氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠溶于250ml去离子水.1 标准曲线的制作：（1）吸取500g/ml硝态氮（NO3-） 标准液1、2、4、6、8、10、12ml分别放入50ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度，使之成10、20、40、60、80、100、120g/ml硝态氮的系列标准溶液。（2）吸取上述系列标准溶液0.1ml，分别放入刻度试管中，以0.1ml去离子水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4ml 5%水杨酸-浓硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20min，再加入8%NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10ml。以空白做参比，在410nm波长下测定吸光度。以硝态氮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。2 样品中硝酸盐的测定 （1）样品液的制备：取一定量的植物材料剪碎混匀，精确称取材料2g，重复3次，分别放入3只刻度试管中，各加入10mL无离子水，封口，置入沸水浴中提取30min取出，用自来水冷却，将提取液过滤到25mL容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。（2）样品液的测定：吸取样品液0.1mL分别于3支试管中，然后加入5水杨酸-硫酸溶液0.4mL，混匀后置室温下20min,再慢慢加入9.5mL 8NaOH溶液，摇匀，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nm波长下测其光密度。在标准曲线上查得或用回归方程计算出硝态氮浓度，计算样品中的硝态氮含量。式中：x为由回归方程计算出的硝态氮浓度，g/ml；V1为样品定容体积，ml；W为样品重量，g；V2为测定取用的样品提取液体积，ml。2. Vc含量的测定 比色法，李合生（2000） (1)1%草酸：1.4g草酸溶于100mL水 (2)2%草酸：2.8g草酸溶于100mL水 (3)30硫酸锌：53.4g溶于100mL水 (4)15%亚铁氰化钾：17.2g溶于100mL水(5)染料溶液：称取100mg 2，6二氯酚靛酚和82mg碳酸氢钠溶于约60mL热水中，过滤定容至100 mL容量瓶中，倒人棕色试剂瓶存放于冰箱内。使用时稀释4倍，此溶液每毫升约相当于0.1mg的维生素C（6）抗坏血酸标准溶液：精确称取100mg分析纯抗坏血酸，溶于1草酸，定容至100mL，再从中吸取5 mL，用1草酸再稀释至100 mL，稀释后每毫升含抗坏血酸0.05mg（标准溶液在使用前临时配制)。（7）二甲苯：分析纯1.标准曲线取具塞大试管6个.分别吸取抗坏血酸标准溶液0mL,lmL,2mL,2.5mL,3 mL,4 mL,用1草酸补充至4mL。各管中抗坏血酸含量相应为0、0.05mg、0.10mg、0.125mg、0.15mg、0.20mg。各管中加人染料溶液2 mL ,随即加入二甲苯5mL ,迅速摇动约0.5min,静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液轻轻倒入1mL比色杯，在500 nm波长下测定吸光度。以二甲苯作空白调零，求得标准系列抗坏血酸毫克数与相应的吸光度值的回归方程。2.样品提取取新鲜蔬菜洗净，擦干，在玻板上用不锈钢刀切碎混匀。称取2g样品放至研钵中，加人3 mL 2草酸研磨至匀浆，然后将匀浆倒至100mL容量瓶中，残渣用1草酸冲洗，洗液一并倒至容量瓶中，加人1 mL 30硫酸锌，摇动容量瓶，再加人1 mL 15亚铁氰化钾，以除去脂溶性色素，再用1草酸定容至刻度，摇匀后过滤到干净三角瓶中。3.测定取上述提取液4 mL(若抗坏血酸含量高，可以适当减少取量，不足4mL的可用1%草酸补足至4 mL)至具塞大试管中，依次加入染料2 mL、二甲苯5 mL，按照标准曲线的方法测定吸光度。每百克鲜样的抗坏血酸含量 ，X是按照回归方程得到的数值，V1为提取液总体积，V2为测定用体积量，W为样品鲜重。简化就是，每百克鲜样的抗坏血酸含量X*12.5。4可溶性糖含量的测定：蒽酮比色法（李合生，2000）（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。（2）浓硫酸：比重1.84标准曲线的制作1、1%蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80下烘至恒重，精确称取1.000 g。加少量水溶解，转入100ml 容量瓶中，加入0.5ml 浓硫酸，用水定容至刻度。2、100g/ml 蔗糖标准液：精确吸收1%蔗糖标准液1ml 加入100ml 容量瓶中，加水至刻度。取20 mL刻度试管11支，从0一10分别编号，按表加人溶液和水。然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，自然冷却到室温，以空白作对照，在630nm波长下测其吸光度。以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。样品可溶性糖含量的测定取鲜样0.5g放入刻度试管中，加入10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，提取液过滤到25ml容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容到刻度，吸取样品提取液0.1ml于20ml刻度试管中，加蒸馏水1.9ml，然后向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分震荡，自然冷却至室温，以空白做参比，在630nm波长下测其吸光度，计算可溶性糖的含量。样品中可溶性糖含量（mg/g） （CVT）/ （VSWF1000）式中：C为查标准曲线值，mg；VT为提取液总体积，ml；WF为样品鲜重，g；Vs为测定时加样量，ml。5可溶性蛋白（考马斯量蓝G-250染色法）（1） 标准蛋白质溶液：100g/ml牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用水稀释至100ml即可。（2） 考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G0250，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）的磷酸，再用水定容到1L，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。 1 标准曲线的绘制 取6支具塞试管，按表加入试剂（0-100g/ml的标准蛋白）。混合均匀后，向各管中加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2 样品测定称取鲜样0.5g，用5ml蒸馏水研磨成匀浆后，10000rpm离心10min，取上清液0.5ml，加0.5ml蒸馏水于试管中（因为浓度可能太大，可加0.1mL样品提取液，加入蒸馏水0.9mL），混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置2min后在595nm下比色测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量 样品中蛋白质含量（mg/g） （CVT）/ （VSWF1000） 式中：C为查标准曲线值，g；VT为提取液总体积，ml；WF为样品鲜重，g；Vs为测定时加样量，ml。6游离氨基酸（1）乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.4）：称取乙酸钠54.4g加入100ml无氨蒸馏水（每升普通蒸馏水中加入25ml 5%NaOH溶液再煮沸1h即可获得无氨蒸馏水），在电炉上加热至沸，使体积蒸发至60ml左右。冷却后转入100ml容量瓶中加30ml冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100ml。（2）水合茚三酮试剂：称取0.6g再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15ml正丙醇，搅拌使其溶解。再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇，最后加入9ml pH 5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置4下保存备用，10天内有效。（3）标准氨基酸：称取80下烘干的亮氨酸46.8mg，溶于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml。取此液5ml，用蒸馏水稀释至50nl，即为含5g/ml 氨基氮的标准液。（4）0.1%抗坏血酸：称取50mg 抗坏血酸，溶于50ml无氨蒸馏水中，随配随用。（5）10%乙酸。制作标准曲线取6支20ml 刻度试管，按表操作加完试剂后混匀，盖上大小合适的玻璃球，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而退去，进而呈蓝紫色时，用60%乙醇定容至20ml。混匀后用1cm光径比色皿在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。样品测定取新鲜植物样品，洗净，擦干并剪碎。混匀后，迅速称取1.0g，于研钵中加入5ml 10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100ml。混匀，并用滤纸过滤到三角瓶中备用。吸取样品滤液1.0ml，放入20ml 干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0ml，其他步骤与制作标准曲线相同。根据样品吸光度在标准曲线上查的含氮量。式中：C为标准曲线上查的的氨基态氮含量，g；VT为样品稀释总体积，ml；Vs 为测定时样品体积，ml；W为样品鲜重，g。附注：（1）茚三酮重结晶的方法：合格的茚三酮应该是微黄色结晶，若保管不当，颜色加深或变成微红色，必须重结晶后方可使用。其方法如下：5g茚三酮溶于15ml水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，溶液太稠时，可适量加水，30min后用滤纸过滤，滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出，用干滤纸过滤，再用1ml蒸馏水洗结晶一次，置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。（2）茚三酮与氨基酸反应生成的Ruhemans紫在1小时内保持稳定，故稀释后尽快比色。 （3）空气中的氧干扰显色反应的第一步。以抗坏血酸为还原剂，可提高反应的灵敏度，并使颜色稳定，但由于抗坏血酸也可以与茚三酮反应，使溶液颜色过深，故应严格掌握加入抗坏血酸的量。（4）反应温度影响显色稳定性，超过80，溶液易褪色；可在80水浴中加热，并适当延长反应时间，效果良好。7. 类黄酮、可溶性总酚的测定参照Pirie等（1976）报道的方法，并予以改良。取0.5g样品，放入10mL的1HCL甲醇溶液室温浸提2小时，倒出浸提液待测。实验的流程如下：50LA+4.5mLBOD280浸提液1mLA+4mLBOD325OD530OD600OD530OD600可溶性总酚类黄酮花色苷注 A为浸提液；B为1盐酸甲醇溶液吸光值增加0.01为一个含量单位即1U0.018. 纤维素（干样）1、试剂（1）60%H2SO4溶液（2）浓H2SO4（3）2%蒽酮试剂：将2g蒽酮溶于100ml乙酸乙酯中，贮放于棕色试剂瓶中。（4）纤维素标准液：准确称取100mg纯纤维素，放入100ml量瓶中，将量瓶放入冰浴中，然后加冷的60% H2SO4 6070ml，在冷的条件下消化处理2030min，用60% H2SO4稀释至刻度，摇匀。吸取此液5.0ml放入另一50ml量瓶中，将量瓶放入冰浴中，加蒸馏水稀释至刻度，则每毫升含100微升纤维素。2.实验步骤求测纤维素的回归方程（1） 取6支小试管，分别放入0、0.40、0.80、1.20、1.40、2.00ml纤维素标准液，然后分别加入2.00、1.60、1.20、0.80、0.40、0ml蒸馏水，摇匀，则每管依次含纤维素0、40、80、120、160、200微克.（2） 向每管加0.5ml 2%蒽酮，再沿管壁加5.0ml浓H2SO4，塞上塞子，摇匀，静置1min。然后在620nm下测定吸光度。（3） 以测得的吸光度为y值，对应的纤维素含量为x值，求y随x而变的回归回归方程。样品纤维素含量测定（1） 称取菜薹干样0.2g于烧杯中，将烧杯置于冷水浴中，加入60%H2SO460ml，并消化30min，然后将消化好的纤维素溶液转入100ml容量瓶中，并用60%H2SO4定容至刻度。摇匀后