GENMED真菌酵母细胞半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书.doc

GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS60013.2 v.AGENMED真菌/酵母细胞-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途GENMED真菌/细胞-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用化学和物理方法，快速有效地裂解真菌细胞，通过高速离心，获得澄清细胞裂解悬液，在-半乳糖苷酶反应体系里，以邻硝基苯基-D- 半乳糖苷为无色底物，水解所产生的亮黄色的邻硝基酚，即采用比色法定量测定细胞裂解悬液制备样品中的-半乳糖苷酶活性，藉此建立一种简单的定量评价报告基因的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的真菌/酵母活体细胞分析。产品即到即用，性能稳定，参数优化，操作简便、比色敏感，堪称国际上同类产品最佳。 技术背景大肠杆菌的标志基因Lac Z编码-半乳糖苷酶（-galactosidase ； -gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中得到。-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此-半乳糖苷酶成为目前最常用的报告基因，以评价载体转染的效果。邻硝基苯基-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-D-galactopyraniside；ONPG），是一种无色底物，以替代乳糖，在-半乳糖苷酶的催化下，水解成无色的半乳糖和亮黄色的邻硝基酚（o-nitrophenol；ONP），通过420nm波长的吸光值分析，来测定-半乳糖苷酶的活性单位。 产品内容GENMED裂解液（Reagent A） 10毫升GENMED强化液（Reagent B） 2毫升GENMED活性液（Reagent C） 250微升GENMED稀释液（Reagent D） 20毫升GENMED反应液（Reagent E） 4毫升GENMED终止液（Reagent F） 10毫升产品说明书 1份保存方式保存GENMED裂解液（Reagent A）、GENMED活性液（Reagent C）和GENMED反应液（Reagent E）在20冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4冰箱里；GENMED反应液（Reagent E）避免光照；有效保证6月用户自备15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于样品操作的容器（微型）台式离心机：用于样品操作比色皿或酶标板：用于比色分析的容器恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育计时器：用于反应计时分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，开启分光光度仪预热，设置波长420nm；开启恒温水槽，设置温度为28。同时从20冰箱里取出GENMED裂解液（Reagent A）、GENMED活性液（Reagent C）和GENMED反应液（Reagent E）置于冰槽里融化；GENMED反应液（Reagent E）避免光照。然后进行下列操作：一、 样品准备1 准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD6000.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升）2 移入到预冷的15毫升锥形离心管3 置于冰槽里5分钟4 放进4台式离心机离心5分钟，速度为1000g5 小心抽去上清液6 加入250微升GENMED裂解液（Reagent A），充分混匀7 转移到预冷的1.5毫升离心管8 加入100微升GENMED强化液（Reagent B）9 加入12.5微升GENMED活性液（Reagent C）10 强力涡旋震荡15秒11 置于冰槽里1分钟12 重复实验步骤10至11五次13 加入250微升GENMED裂解液（Reagent A），充分混匀14 放进4微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）15 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管16 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）17 即刻放进70保存或置于冰槽里继续后续操作二、 活性检测方法一：常规检测（比色皿）1 移取100微升上述制备的细胞裂解悬液样品到新的比色皿2 加入900微升GENMED稀释液（Reagent D）3 上下倾倒数次，混匀4 放进28恒温水槽孵育5分钟5 加入200微升GENMED反应液（Reagent E）（注意：使用前，充分混匀GENMED反应液（Reagent E）中可能的沉淀） 6 上下倾倒数次，混匀，同时开启计时器进行计时7 放进28恒温水槽孵育至少10分钟，或直至出现亮黄色（注意：参见注意事项15）8 加入500微升GENMED终止液（Reagent F），同时关闭计时器结束计时9 记录反应所用的实际时间10 即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数，理想读数为0.1至1.2范围内方法二：微量检测（酶标板）1 移取10微升上述制备的细胞裂解悬液样品到酶标板中的1个孔里2 加入150微升GENMED稀释液（Reagent D）3 轻轻摇动酶标板数次，混匀4 放进28培养箱孵育5分钟5 加入50微升GENMED反应液（Reagent E）（注意：使用前，充分混匀GENMED反应液（Reagent E）中可能的沉淀） 6 轻轻摇动酶标板数次，混匀，同时开启计时器进行计时7 放进28培养箱孵育至少10分钟，或直至出现亮黄色（注意：参见注意事项15）8 加入90微升GENMED终止液（Reagent F），同时关闭计时器结束计时9 记录反应所用的实际时间10 即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数，理想读数为0.1至1.2范围内三、 菌落直接检测1 移取100微升GENMED裂解液（Reagent A）到1.5毫升离心管2 加入900微升GENMED稀释液（Reagent D）3 使用牙签、200微升枪头或接种环挑选1个完整菌落4 涡旋震荡15秒，混匀5 放进分光光度仪检测，波长为600nm，记录读数6 放进28恒温水槽孵育5分钟7 加入200微升GENMED反应液（Reagent E）（注意：使用前，充分混匀GENMED反应液（Reagent E）中可能的沉淀） 8 上下倾倒数次，混匀，同时开启计时器进行计时9 放进28恒温水槽孵育至少10分钟，或直至出现亮黄色（注意：参见注意事项15）10 加入500微升GENMED终止液（Reagent F），同时关闭计时器结束计时11 记录反应所用的实际时间12 放进4台式离心机离心30秒，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）13 小心移取上清液到比色皿14 即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数，理想读数为0.1至1.2范围内四、 计算样品活性计算一：按照操作步骤规定1 比色皿计算：样品读数 X 1.7（反应体积，毫升）0.1（样品容量，毫升）X 4.5（毫摩尔吸光系数）X 反应时间（分钟）微摩尔ONPG /分钟/毫升2酶标板计算： 样品读数 X 0.3（反应体积，毫升）0.01（样品容量，毫升）X 4.5（毫摩尔吸光系数）X 0.6（厘米）X反应时间（分钟）微摩尔ONPG /分钟/毫升计算二：基本公式样品读数X样品稀释倍数 X反应体积（毫升）反应样品悬液容量（毫升）X 4.5（毫摩尔吸光系数）X比色皿距径（厘米）X 反应时间（分钟）微摩尔ONPG /分钟/毫升计算三：（微摩尔ONPG /分钟/毫升）换算成（微摩尔ONPG /分钟/毫克样品蛋白）实际活性值（微摩尔ONPG /分钟/毫升）实际样品蛋白浓度（毫克/毫升）微摩尔ONPG /分钟/毫克样品蛋白注意事项1 本产品为20次（比色皿）操作2 建议使用核内表达的载体代替胞内表达的载体转染或感染细胞3 本产品的各项参数达到最优化4 建议操作时，注意避光5 操作时，须戴手套6 GENMED强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用1毫升枪头，将尖端部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满；或秤重0.1克7 GENMED反应液（Reagent E）避免光照和反复冻融8 用户可以测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用GENMEDBradford蛋白质浓度定量检测试剂盒（GMS30030.1）9 如果用户需要测定背景空对照，可以完全按照活性检测的操作步骤进行，唯一变化在于100微升样品改成100微升GENMED裂解液（Reagent A）替代10 如果用户测得背景空对照，计算活性时，勿忘（样品吸光读数背景空对照读数）11 反应孵育时间的理想范围为10分钟至60分钟内出现亮黄色显色：低于5分钟表明酶活性过高，建议稀释样品，否则影响检测精度；大于60分钟表明酶活性较低，建议增加样品量，最好不要增加孵育时间12 如果增加孵育时间3小时以上，可能产生反应底物的自动水解，影响检测精度13 如果用户样品有限，转染困难，且酶活性过低，必须大量增加孵育时间，建议使用GENMED-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒（GMS10060）14 样品的酶活性吸光值在0.1至1.2 OD单位为理想状态，其酶活性与吸光值成线性正相关；吸光值在0.3至0.9 OD单位为完美状态15 亮黄色显色的标准为等同于新鲜的LB培养液作为色彩参照，同时作为反应终止的标准16 反应终止后，即刻进行比色测定17 比色测定后，比色皿须清洗彻底18 酶活性单位浓度定义：在37温度下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔的邻硝基苯基-D-半乳糖苷19 本公司提供系列-半乳糖苷酶检测试剂产品质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测敏感使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。友情提醒IF IT DOESNT WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。订购信息编号名称规格GMS60013.2GENMED真菌/酵母细胞-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒20次GMS60013.2AGENMED裂解液（Reagent A） 100毫升GMS60013.2BGENMED强化液（Reagent B）10毫升GMS60013.2CGENMED活性液（Reagent C）1毫升GMS60013.2DGENMED稀释液（Reagent D）100毫升GMS60013.2EGENMED反应液（Reagent E）10毫升GMS60013.2FGENMED终止液（Reagent F）100毫升产品编号名称规格GMS10010.1细胞-半乳糖苷酶原位染色试剂盒100/250次GMS10010.2全组织-半乳糖苷酶原位染色试剂盒10次GMS10010.3冰冻切片-半乳糖苷酶原位染色试剂盒50次GMS10010.4 通用型组织/细胞-半乳糖苷酶原位染色试剂盒10/100次GMS10012.1细胞衰老特异性-半乳糖苷酶原位染色试剂盒100/250次GMS10012.2全组织衰老特异性-半乳糖苷酶原位染色试剂盒10次GMS10012.3冰冻切片衰老特异性-半乳糖苷酶原位染色试剂盒50次GMS10012.4 通用型组织/细胞衰老特异性-半乳糖苷酶原位染色试剂盒10/100次GMS60003.1细菌半乳糖苷酶活性原位染色试剂盒40次GMS60003.2细菌-半乳糖苷酶活性化学发光法定量检测试剂盒20次GMS60003.3细菌-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒20次GMS60003.4细菌-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒20次GMS10037.1动物细胞-半乳糖苷酶活性化学发光法定量检测试剂盒20次GMS10037.2动物细胞-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒20次GMS10037.3动物组织-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒20次GMS60013.1真菌/酵母细胞-半乳糖苷酶活性化学发光法定量检测试剂盒20次GMS60013.2真菌/酵母细胞-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒20次GMS60013.3真菌/酵母细胞-半乳糖苷酶活性滤膜染色试剂盒20次GMS60013.4真菌/酵母细胞-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒20次GMS10060.1动物细胞-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒20次GMS10060.2动物组织-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂盒20次联系我们关于订购详情或技术支持，欢迎来电、来函、传真或电邮GENMED SCIENTIFICS INC. 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