遗传学实验.doc

题目：微核检测技术系 别： 生物工程系专 业： 生物工程姓 名： 田振阳学 号： 1114092（33）指导教师： 单林娜 一、引言微核试验是反映染色体损伤的重要试验方法,已广泛应用于遗传、食品、药物、环境等多领域的遗传毒性评估,以及作为有害职业和生活环境暴露人群遗传损害的生物标志物。微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核13以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。且有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率可达99%以上。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。本实验的目的是学习蚕豆根尖的微核测试技术，并了解微核测试原理和毒理遗传学意义。二、实验材料 实验器具： 显微镜，手动计数器，镊子，载玻片，盖玻片，烧杯，瓷盘，紫外线诱变箱等。实验药品： 1mol/L盐酸，甲醇，冰醋酸，醋酸洋红染色液，NaN3，蚕豆种子。三、实验方法1实验材料的培育 蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而对诱变因子反应敏感。种子成熟后，晒干贮藏于干燥器内或4冰箱内备用。 2浸种催芽： 将实验用蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯中，在25下浸泡24小时。种子吸胀后，用纱布松散包裹置白磁盘中，保持湿度，在25恒温箱中催芽12-24小时，待初生根长出2-3mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的磁盘中，25继续催芽，经约36-48小时，大部分初生根长至1-2cm左右，根毛发育良好，这时即可用来进行检测了。3处理 每一处理选取6-8粒初生根生长良好、根长一致的种子，放入盛有待测物溶液的培养皿中，浸没根尖。阳性因子采用3min，6min及9min紫外线照射和NaN3 1.5mol/L四组，用蒸馏水作对照处理，处理根尖24h。4根尖细胞恢复培养 将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次，每次2-3min。将洗净的种子再放入铺好滤纸或脱脂棉的白磁盘内，25温箱中恢复培养22-24小时。5固定根尖细胞及制片(参考根尖压片法)(1)将恢复培养后的种子，从根尖顶端，切下1cm长的幼根。用甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定24h，固定后如果不及时制片，可换入70% 的乙醇中，置4冰箱内保存备用。6酸解： 用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次5min，吸净蒸馏水，放入预热的1mol/L盐酸60oC恒温解离15min，幼根软化即可。7染色 ： 吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根三次，每次12min。最后浸于水。制片时置于载玻片上，截下12mm左右长的根尖，滴一滴醋酸杨红染液，染色58min，加盖玻片，压片观察。8镜检及微核识别标准 首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。9.微核识别标准：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。 观察5个根尖，每个根尖计数250个细胞中的微核数，然后平均即为该处理的微核千分率，以此可做一个检测指标。 五、实验结果与分析通过SPSS软件对本次实验中，本小组及所属大组的实验结果进行分析，如下：小组结果处理如下： 紫外线照射组 主体间因子 N照射时间83103123 误差方差等同性的 Levene 检验a因变量:微核率Fdf1df2Sig.1.29926.340检验零假设，即在所有组中因变量的误差方差均相等。a. 设计 : 照射时间多重比较因变量:微核率(I) 照射时间(J) 照射时间均值差 (I-J)标准误显著性95% 置信区间下限上限LSD810.3996671.425202.789-3.087683.88701122.2726671.425202.162-1.214685.76001108-.3996671.425202.789-3.887013.08768121.8730001.425202.237-1.614345.36034128-2.2726671.425202.162-5.760011.2146810-1.8730001.425202.237-5.360341.61434描述微核率N均值标准差标准误均值的 95% 置信区间极小值极大值下限上限836.273671.583333.9141382.3404510.206884.4527.3191035.87400.985490.5689733.425918.322094.7406.5231234.001002.3795531.373836-1.910149.912141.9006.585总数95.382891.840981.6136603.967796.797991.9007.319 NaN3主体间因子NNaN31.803主体间效应的检验因变量:微核率源I 型平方和df均方FSig.模型175.063a1175.06352.848.018NaN3175.0631175.06352.848.018误差6.62523.313总计181.6883a. R 方 = .964（调整 R 方 = .945） 清水组 主体间因子N阴性对照清水3主体间效应的检验因变量:微核率源I 型平方和df均方FSig.模型19.738a119.7384.383.171阴性对照19.738119.7384.383.171误差9.00724.503总计28.7443a.