PCR(聚合酶链式反应)技术与应用.doc

PCR（聚合酶链式反应）技术与应用一 PCR技术的原理聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应，是极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。其反应原理与细胞内DNA复制相似，但PCR反应体系要简单得多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶及适合的缓冲体系。与细胞内的DNA复制相似，PCR也是一个重复地进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。PCR包括下列三步反应：（1） 变性（denaturation）：将反应体系混合物加热到94维持较短时间（大约1530s），是目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。（2） 退火（annealing）：将反应体系冷却至特定温度（引物的Tm值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板-引物复合物。必须精确的计算退火的温度以保证引物只与相对应的序列结合。由于模板链分子较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此，DNA模板单链之间互补结合的机会很少。（3） 延伸（elongation）：将反应体系的温度提高到72并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，合成新的DNA链。因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成新的双链，且双链中的新生DNA单链具有各种不同的延伸长度。以上三步作为一个循环重复进行，每一个循环的产物作为下一循环的模板。因此，在第二轮循环中进行变性、退火、延伸这三步反应。如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。而所有上述过程将在12h内完成。经过扩增后的DNA产物为大多介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片段，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环不断地进行稀释至可以忽略的程度。二 PCR的反应体系PCR的基本反应体系包括：需要扩增的模板(template)、一对寡核苷酸引物（primers）、维持pH的反应缓冲系统（reaction buffer system）、一价或二价阳离子（monovalent or divalent cations）、四种三磷酸脱氧核糖核酸（dNTP）、催化依赖模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶及PCR促进剂等。（1） 模板模板可以是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、扩增后的DNA、cDNA等，对RNA的扩增要首先反转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环。含有靶序列的DNA可以单链或双链形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子（未消化的真核基因组）DNA，因此PCR反应前用机械剪切或用切点罕见的限制酶（Sac I或Not I）消化基因组DNA，以提高产量。反应中PCR模板的用量依DNA的性质而定，用哺乳动物基因组DNA、酵母、细菌和质粒做模板时，每个反应的模板量分别为1g、10ng、1ng和1pg。DNA样品要尽量纯净，尤其不能有核酸酶及蛋白水解酶等有害于PCR反应的物质存在。（2） 引物 PCR扩增产物的大小及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的。因此，引物的选择关系到PCR的特异性。a) 引物设计的原则引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能的抑制非特异性扩增。引物设计的基本要求如下：I 引物的长度 至少为16bp,通常为1830bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性（efficiency），扩增出的产物种类会增多。II 解链温度（Tm值） 引物的Tm值是一个非常重要的参数，Tm值的高低决定退火的温度。两个引物之间的Tm值差异好在5之内，可以保证两个引物正确退火。Tm值的计算方法很多，一般推荐采用专业的引物设计软件进行计算。III G+C含量 G+C含量一般在40%60%。四种碱基随机分布，避免碱基堆积的现象。IV 引物自身 引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列，否则引物会自身折叠，形成发夹形结构，影响引物与待增DNA中的靶序列杂交结合。V 引物之间 引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互不重叠，以避免形成引物二聚体。VI 3末端 3末端最好是G、C。避免使用A、T。也不应有3个连续G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补，从而影响PCR的特异性。VII 5末端 引物的5末端并无严格限制，在与模板结合的引物长度足够的前提下，其5末端可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些序列对寡核苷酸引物与模板的结合的影响并不显著。因此，引物的5末端可以被修饰，如附加限制酶酶切位点、引入突变位点、标记生物素、荧光物质、地高辛等。加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。在后续的扩增循环中，这些与模板未配对的序列将被带到PCR产物的双链中，故在其PCR产物中，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。VIII 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或者有连续8个碱基同源。IX 引物的简并性 引物的3端应为保守的氨基酸序列，如Met、Trp，并且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于3端。（3） 反应缓冲系统PCR的缓冲液一般制成10，但用时要稀释到1： 10PCR缓冲液 500 mmol/L KCl100 mmol/L Tris-HCl(pH8.3，室温)15 mmol/L MgCl20.1% 明胶或乙酰BSA PCR缓冲液是一个非常重要的影响因素。10缓冲液中用的100 mmol/L Tris-HCl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。10缓冲液中500 mmol/L KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性。溶液中的明胶或乙酰BSA是保护酶不变性失活。Mg+非常重要，能影响Taq酶的活性，直接影响反应的特异性和扩增DNA的产率。dNTP的磷酸基团以及引物、模板中的带来的EDTA等螯合剂都要结合Mg+。Taq DNA聚合酶需要的是游离的Mg+，因此要将Mg+浓度调至最佳。许多公司出售的PCR试剂盒中，都带有不含Mg+的缓冲液和单独的Mg+。在正式实验前，可设置在一定浓度的模板、引物、4中dNTP和循环参数下，PCR反应缓冲液中不加Mg+，Mg+是从贮存液中单一加入，并按0.5 mmol/L递增进行（0.5、1.0、1.5、2、2.05.0 mmol/L），在确定大概浓度后，以0.2 mmol/L递增或递减来精确确定Mg+的的最佳浓度。（4） dNTPdNTP常用的浓度为20200mol/L,而且4种dNTP的终浓度相等。dNTP浓度过高虽可加快反应速率，但会增加碱基的错误参入率，适当的低浓度会提高反应的精确度。另外，dNTP是磷酸根的来源，会与Mg+结合，影响反应混合物中游离Mg+的浓度。因此，Mg+的总量应比dNTP的浓度高0.22.5mmol/L/。购买dNTP原液（100200mmol/L）后最好分装成小份，贮藏于-20，避免反复冻融。（5） 耐热DNA聚合酶1983年美国的PE-Cetus公司的Kary Mulis使用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段首先建立了PCR技术，其延伸温度为37。然而，由于Klenow片段在95的DNA解链温度下完全失活，因此在每轮循环步骤之后都需要添加新酶，操作十分繁琐。并且在反应体系中形成快速沉积变性的酶蛋白。此外，由于Klenow片段聚合反应温度偏低，引物与模板的非特异性结合增加，导致非特异性结合增多；同时，由于受到某些DNA二级结构的影响，聚合反应不完全，而不到完整的PCR产物。直到1987年，发现了热稳定的Taq DNA聚合酶（Taq pol）等耐热DNA聚合酶后，才使PCR技术有了重大的发展并逐步实现了自动化。耐热DNA聚合酶（thermostable DNA polymerase）能经受95以上的高温而不失活，因此无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应最适温度为7080，此时引物与模板结合特异性好，故产物纯度高。现已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性，但各耐热DNA聚合酶的性能上有一定差别。目前在PCR中应用最多的是Taq pol。Taq DNA聚合酶具有高热稳定性、高催化活性、忠实性、反转录活性，非模板依赖的聚合活性。其他常用的耐热DNA聚合酶有重组Taq DNA聚合酶（如重组Taq DNA聚合酶rTaq pol）、Th DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Sac DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶。其中Pfu DNA聚合酶及Vent DNA聚合酶具有35外切酶活性，具有校正功能。三. PCR的反应温度和循环参数（1） 常规程序将PCR反应所需的成分配置完成后，在PCR仪上于9496预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后将温度降到复性温度（一般5060之间），保持30s,使引物与模板充分退火；在72保持1min(扩增1kb的片段)，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环2535次，使扩增的DNA片段大量积累。在后在72保持37min，使产物延伸完整，4保存。（2） 复性（退火）和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在5060之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定，并通过预实验来判断。随温度增高，引物与模板结合的特异性增强，非特异性扩增的几率降低，但扩增效率也随之下降。反之，随温度降低，引物与模板结合的特异性减弱，扩增出的产物种类也随之增加。延伸温度绝大多数设定为72。如果复性温度很高，可以将延伸温度和复性温度设定为同一温度，变成两步法PCR。（3） 反应时间PCR反应时间相对较好把握。在变性步骤中一般使用30s，如果模板G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间30s一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1min来保证足够的时间。有的情况下，为更好的保证延伸时间，再10个循环后，每次延伸增加10、30或60s。（4） 循环次数循环次数决定着扩增程度。在其他参数都以优化的前提下，循环次数决定于最初靶分子的浓度。在模板拷贝数为104105数量级时，循环通常为2535次。循环次数过多会增加非特异性产物产量及碱基错配数。此外，循环次数过多以致dNTP和引物浓度不断下降，酶活力降低等使产物数量产生类似于细菌生长曲线稳定期的“平台效应”。循环次数太少会影响正常PCR产物量。四. PCR产物的检测PCR完成以后，必须通过严格的检测分析以确定是否得到准确可靠的特定扩增产物。目前，已经发展出许多检测分析PCR扩增产物的方法。常见的检测方法有：凝胶电泳法、核酸探针杂交法、酶谱分析法、DNA酶免疫试验法、PCR酶联免疫吸附法（PCR-ELISA）、颜色互补分析法、序列分析法、PCR-HPLC法、单一核苷酸引物延伸法（SNUPE）、PCR-寡核苷酸连接检测法（PCR-OLA）和单链构型多态性分析法等。下面介绍2种常用的方法：凝胶电泳检测法、序列分析法。（1） 凝胶电泳检测凝胶电泳是检测PCR产物最常用、最简便的方法。通过凝胶电泳检测，我们可以判断PCR扩增产物的大小。根据检测的目的基因不同，PCR扩增后可产生不同大小的扩增片段，如大片段的扩增产物其分子量大，在凝胶电泳中的泳动速度就慢，而小片段的扩增产物在电泳中的泳动速度则快。因此，通过凝胶电泳判断扩增片段的大小就可以满足检测的需要。常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者主要用于检测大于500bp的DNA片段，而后者主要用于检测小片段DNA。 （a） 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是实验室最常用的PCR产物检测方法，操作简便易行，仅需少量的扩增产物即可进行检测。其原理是在琼脂糖凝胶电泳时，由于不同大小的DNA分子所带电荷的差异而具有不同的电泳速度，从而在琼脂糖凝胶中分离，然后经溴化乙锭（EB）染色后在紫外光照射下使其发射荧光从而测定其在凝胶中的位置。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，虽然琼脂糖凝胶电泳得分辨率较低，但其分离范围广，电泳检出率在110ng DNA以上。（b） 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与琼脂糖凝胶电泳相同。与琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺电泳具有如下优点：分辨率很强，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开；能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶，多达10g的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm1cm）而不致显著影响分辨力；从凝胶中回收的DNA纯度很高。凝胶电泳检测法，扩增产物现实的方法主要有溴乙锭（EB）染色和银染法两种。(2) 序列分析法凝胶电泳检测的方法可以检测扩增条带的大小，但对于产物DNA序列的的具体情况无从得知。如对某病原微生物保守区段进行PCR扩增来对某疾病进行确诊，只需要知道产物条带的大小而不需要考虑扩增中的错配。若进行分子克隆则需要产物的序列也是正确的，这时可采用序列分析法。序列分析法是将PCR产物直接进行测序分析，该法是PCR产物分析最精确的方法，最常用的是Sanger双脱氧链终止测序法。五. 几种PCR反应举例实验室采用的PCR种类很多，常见的有如下几种：普通PCR、原位PCR、定量PCR、RT-PCR、套式PCR、多重PCR等。下面介绍其中的三种：普通PCR、RT-PCR和多重PCR。（1） 普通PCR（a） 实验原理普通PCR原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。典型PCR反应体系有如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成DNA引物，耐热Taq聚合酶。a) 变性：加热模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条链，即变性阶段。b) 退火：使溶液温度降至5060，模板DNA与引按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。c) 延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种dNTP，按53方向复制出互补DNA，即引物的延伸。上述三步为一个循环，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段。从理论上说，每经过一个循环，样本中的DNA量应增加一倍。新形成的链又可新一轮的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109。（b） 仪器、材料和试剂a） 仪器I PCR热循环仪II 琼脂糖凝胶电泳系统III 凝胶成像仪或紫外透射仪或Dark Readerb） 材料与试剂I 2.5mmol/L dNTP混合物II Taq酶 5U/LIII DNA模板 1ng/LIV 一对引物：正向引物：5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3(BamH I)反向引物：5GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGCG3(Hind III)引物浓度：10mol/mLV 10PCR bufferVI Mg+VII 50TAE (见附录)VIII 10loading bufferIX DNA Markerc） 实验步骤I PCR扩增目的基因i. 在0.2mLPCR管内配制50L反应体系10PCR buffer 5L2.5mmol/L dNTP混合物 4L25mmol/L Mg+ 4L正向引物（20mol/L） 1L反向引物（20mol/L） 1L模板DNA 1LTaq 0.2L(1U)双蒸水 补足至50Lii. 按下述程序扩增94 预变性 5min94 变性 30s55 退火 30s72 延伸 2min重复步骤24，30次72 延伸 7minII 琼脂糖电泳分析PCR结果配制1%琼脂糖凝胶（1TAE），5L PCR产物+3L 10loading buffer，恒压80V。凝胶成像仪或紫外透射仪或Dark Reader观察记录电泳结果。注意：一般的DNA Marker 都会有12条色素标记，分别为溴酚蓝（Bromophenol Blue）和二甲苯氰FF(Xylene Cyanol FF)。通过可见的色素的迁移，监控不可见的DNA的相对运动。溴酚蓝在0.5%1.4%的琼脂糖凝胶中约与300bp的双链线性DNA的迁移速率相同（在0.5TBE中）， 二甲苯氰FF则与4kbp的双链线性DNA的迁移速度相同。DNA Marker各条带的亮度不一样，分别代表不同的DNA含量。可通过这种方式对产物中的DNA含量进行粗略的估计。如果想知道产物DNA具体的浓度，可通过紫外分光光度计测定OD260、OD280两个数值。1.8OD260/ OD2802.0,说明核酸含量较纯；OD260/ OD2802.0，说明样品中残存RNA较多；OD260/ OD2801.8说明样品中有蛋白质、氨基酸或酚等有机杂质，需进一步纯化。当OD 260=1时，样品中相当于50g/mL的双链DNA或40g/mL的单链DNA。 DNA浓度=OD260的值稀释倍数501000（2） RT-PCR(a) 基本原理反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）的基本原理是由mRNA反转录产生cDNA链作为模板进行PCR扩增。以RNA模板反转录（RT）为cDNA一链，再以cDNA一链复制出cDNA二链。分别以cDNA一、二链为模板，进行PCR扩增，通过电泳检测PCR产物，并定量分析以间接了解组织细胞中的mRNA的表达及含量。两步RT-PCR法可以使用oligo(dT)或随机引物引导cDNA第一链的合成。因此，可以一个特定的样品中反转录出所有的mRNA的信息。此外，两步法可将反转录产物分别进行多重不同的PCR，因此可以从一个样品解答多个问题。一步法可使RT及PCR过程在单管和单一的缓冲液中完成。RT完成以后不需要打开反应管、消除了不必要的加样过程，同时可避免污染。这种方法比RT及PCR分开的过程更方便。RT-PCR的特点是灵敏并且用途广，可用于检测产生的转录产物，确定某一基因转录物的存在与否，分析表达的水平；在无需构建和筛选cDNA文库时，克隆cDNA产物。(b) 实验方法I 主要试剂i 细胞总RNA或mRNA。ii 10 反转录缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl，pH8.3，0.4mol/L KCl，70mmol/LMgCl2,10mmol/L DTT，1mg/mL BSA。iii dNTPs。iv 随机引物，目的基因引物。v AMV反转录酶。vi RNA酶抑制剂。vii Taq 酶。II 操作步骤i 反转录反应 20L反应体系内，包括2L细胞总RNA或mRNA、1U/L AMV反转录酶、50pmol随机引物、1U/L RNA酶抑制剂、500mol/L dNTPs、10反转录缓冲液 2L和50mmol/L MgCl2。42反应30min， 95加热10min灭活反转录酶，4保存。ii 聚合酶链式反应 50L反应体系内，包括1.5mol/L MgCl2，200mol/L dNTPsiii 琼琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，紫外灯下观察结果或光吸