细胞色素C的提取.doc

细胞色素C的提取1、 实验目的1、 掌握提取细胞色素C的原理。2、学习提取细胞色素C的操作技术。3、了解吸附法的原理和方法。2、 实验原理细胞色素C是一种含有铁卟啉基团的蛋白质，是细胞色素的一种，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，是呼吸链的一个重要组成成分。细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。细胞色素C溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，制品可分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分失活。吸附法指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C。3、 实验试剂和器材试剂1、2mol/L硫酸溶液2、1mol/L氨水溶液3、0.2%氯化钠溶液4、25%硫酸铵溶液5、20%三氯乙酸溶液6、 人造沸石7、 猪心器材磁力搅拌器、组织匀浆机、层析柱、恒流泵4、 实验步骤1、 材料处理取新鲜或冷冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心搅成小块。2、 提取称取碎猪心肌肉100g，放入500ml烧杯中，加蒸馏水200ml，搅匀，用硫酸调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取0.5h。提取完毕，用氨水调pH至6.0，搅拌均匀，停止搅拌。用八层普通纱布挤压过滤；滤渣加入750ml蒸馏水，再按上述条件提取0.5h，两次提取液合并。3、 中和用氨水调上述提取液至pH7.2（此时，等电点接近pH7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来），静置3040min后过滤，所得滤液准备通过人造沸石柱进行吸附。4、 吸附与洗脱人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25%的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其它杂质蛋白分开。具体操作如下：（1） 人造沸石的预处理：称取人造沸石15g，放入500ml烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12s内不下沉的过细颗粒。（2） 吸附：采用静态吸附法，搅拌吸附细胞色素C，使人造沸石逐渐由白色变为红色。（3） 装柱：连接洗净的层析玻璃柱，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入2cm左右蒸馏水，保持柱垂直，然后将已吸附细胞色素C的人造沸石带水装入柱中（吸附有细胞色素C的人造沸石先用自来水清洗，再用蒸馏水清洗至清，再用氯化钠溶液清洗3次，再用蒸馏水清洗至水清），避免柱内出现气泡。（4） 洗脱：柱装好后，打开夹子放水（柱内沸石面上应保留一薄层水）将准备好的洗脱液（硫酸铵溶液）利用恒流泵将其泵入层析柱上口，使其通过人造沸石柱进行吸附。保持柱下端流速约2ml/min，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色消失时，即洗脱完毕。5、 盐析为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加入固体硫酸铵（按每100ml洗脱液加入20g固体硫酸铵的比例，使溶液硫酸铵的饱和度为45%）边加边搅拌，放置1530min后，杂蛋白便从溶液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸（或离心）除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。6、三氯乙酸沉淀在搅拌情况下向所得透亮溶液加入20%三氯乙酸，细胞色素C立即