2010CB912000-神经元信息感受重要蛋白质膜转运的结构基础、调控及功能研究.Doc

项目名称：神经元信息感受重要蛋白质膜转运的结构基础、调控及功能研究首席科学家：罗建红 浙江大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容（1）离子通道和受体的内质网质量控制机制：系统分析电压门控钠离子和钙离子通道、谷氨酸受体通道及G蛋白偶联受体的内质网驻留/返流信号，发现新的内质网驻留/返流信号和关键结构域，筛选参与离子通道/受体内质网质量控制的关键相互作用蛋白，探讨蛋白磷酸化的调节作用，提出内质网质量控制新的分子机制；（2）离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制：分析离子通道/受体转运的囊泡类型和转运模式，筛选和鉴定与转运环节相关的蛋白质复合物组分、离子通道和受体分选的分子内部信号及其相互作用和调控机制，研究马达蛋白和细胞骨架在离子通道和受体的囊泡和细胞器转运中的作用和机制；（3）受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程及其机制：分析谷氨酸受体、G蛋白偶联受体及酪氨酸激酶受体在神经元膜表面分布、突触定位、内化及再循环的分子和细胞机制，解析相关的受体结构域、调控位点及相互作用蛋白，探讨磷酸化和泛素化对相关环节的调控；（4）离子通道的膜转运与神经元兴奋性调控：探讨电压门控钠离子和钙离子通道转运插入细胞膜数量的调控机制，分析离子通道在细胞膜上数量的改变对其电流和神经元兴奋性变化的贡献，提出离子通道膜转运调控神经元递质释放和信号传导的新机制；（5）突触后受体的动态变化与突触可塑性：研究在突触可塑性产生过程中突触后受体（特别是谷氨酸能受体）的数量和构成的动态变化及其受体亚型对不同类型突触可塑性形成的作用，探讨关键激酶和磷酸酶参与该过程协同调控机制，提出调节受体转运影响突触可塑性的新机制。二、预期目标（一）总体目标高度特化的神经元是神经网络形成和神经信息正确处理的结构和功能基础，而负责信息感受的离子通道和受体蛋白在神经元的正确定位和动态调节对此具有特殊重要的意义。本项目整合了在相关领域已做出优秀工作的科学家，拟选择一组与神经信息感受和传导密切相关的离子通道和受体蛋白，系统研究其膜转运的关键结构域、相互作用蛋白质、磷酸化等调节及对神经元兴奋性和突触功能的调控。通过发现新机制和新规律，加深对神经信息处理过程中关键蛋白质分子结构和功能基础及其相互关系的理解。通过该项目的实施获得一系列具有国际领先和拥有自主知识产权的研究成果，同时凝聚和造就一支在该领域达到国际先进水平的研究队伍。（二）五年预期目标1. 在基础理论研究方面：（1） 系统分析电压门控钠离子和钙离子通道、谷氨酸受体通道、G蛋白偶联受体及酪氨酸激酶受体膜转运所依赖的分子内部信号和关键结构域，重点解析并得到若干新的内质网驻留/返流、内吞和再循环、囊泡转运和分选的信号或关键结构域；（2） 鉴定参与电压门控钠离子和钙离子通道、谷氨酸受体通道、G蛋白偶联受体及酪氨酸激酶受体膜转运的关键相互作用蛋白，阐明磷酸化或泛素化对蛋白相互作用的调控机制，提出新的蛋白相互作用模型；（3） 阐述电压门控钠离子和钙离子通道、谷氨酸受体通道、G蛋白偶联受体及酪氨酸激酶受体膜转运对神经元兴奋性和突触可塑性的调控作用，深化离子通道和受体膜转运对神经信息处理调控的认识。2. 成果考核指标： 在国际一流杂志（IF10）发表论文5 - 8篇，在有影响力的杂志（IF5）上发表论文 25 - 30 篇。3. 人才培养：培养研究生50 - 80人，培养出学科领军型人才3 - 5名。三、研究方案（一） 学术思路蛋白质是生命活动也是神经信息处理的主要执行者，其功能具有不同层次的解析。蛋白质本身的结构和功能是一个基本层次，然而，细胞内大多数蛋白质则通过蛋白质蛋白质的相互作用、蛋白质复合物及其网络的形成、以及与亚细胞结构复杂的相互作用等才最后达成具有细胞生理学意义的功能，这里包含了蛋白质表征细胞生命活动时所需要的精确、有序的时空调控。神经元信息处理相关的离子通道和受体如何通过其分子内部信号、关键结构域和相互作用蛋白来决定和调节膜转运，达成正确的分布和定位并实现其在神经元中的功能，这是一个蛋白质科学与神经科学相结合的重要前沿科学问题。本项目以理解神经信息处理为引导，以与神经信息感受和传导相关的一组离子通道和受体为研究对象，围绕膜转运（内质网质量控制、囊泡分选和转运、膜和突触定位及内化再循环）这条主线，采用分子生物学、分子遗传学、生物化学、蛋白组学、组织细胞免疫化学、活细胞荧光成像和电生理学等多层次先进研究技术组合，以解析蛋白质分子内部信号或结构域、鉴定相互作用蛋白质、阐明调控机制及与神经元信息处理关系为立足点，对上述的蛋白质活动过程中结构和功能的基本问题进行系统研究（见下图），力争做出国际领先水平的研究工作，提升我国在该领域的学术地位。（二） 技术途径本项目选择的研究对象是一组与神经信息感受和传导相关的膜蛋白，对其膜转运及调控的研究手段上具有共性，但针对膜转运的不同环节、调控机制及功能关系等研究又需要有不同的技术组合。总体来说，本项目对研究内容和目标强调整体设计，结合原有的研究基础，将同时采用假设驱动和探索驱动的研究策略。强调综合运用基因、蛋白质、细胞组织及整体多层次现代生物学研究技术，对目标蛋白质膜转运不同环节的机制进行解析，着眼于解析蛋白质（包括新鉴定的相互作用蛋白质）内部信号或关键结构域、相互作用机制、膜和突触定位及动态转运、磷酸化等修饰调节机制，以达成对神经元兴奋性和突触功能调节更为深入的理解。神经元信息感受和传导相关的重要蛋白酪氨酸激酶受体G蛋白偶联受体离子型谷氨酸受体电压门控离子通道结构相关信息的分析内部信号或关键结构域的鉴定囊泡分选和转运膜和突触定位内化和再循环内质网质量控制膜蛋白转运和定位环节分子及遗传学技术（基因突变和基因敲除）电生理技术和药理学方法神经元兴奋性和突触功能调节生物化学技术（生化及蛋白质组学技术）蛋白质相互作用：1. 新蛋白质的鉴定2. 分子机制研究组织细胞免疫化学和活细胞荧光成像技术亚细胞定位/动态转运蛋白质磷酸化等修饰神经系统信息处理神经信息传导和可塑性调控总体研究方案的学术思路和技术途径示意图离子通道和受体的内质网质量控制机制离子通道/受体要表达到细胞膜上并履行其功能，必须首先要通过内质网的质量监控。只有正确折叠，装配，暴露出一些前向运输信号或者屏蔽掉ER滞留/返流信号，甚至是具备正常功能的离子通道/受体才能表达到细胞膜上。否则，它们将被滞留在内质网，或者启动内质网相关降解途径（ER associated degradation, ERAD）被降解，或者因过分堆积而引起相应的病理过程。到目前为止，一些神经系统相关的重要离子通道/受体的内质网质控机制并不是非常清楚，即便有些离子通道/受体虽然鉴定出存在某种内质网驻留/返流信号，但是其内在的分子机制不是非常清楚，这些信号是如何发挥作用，又是如何被屏蔽的还需要进一步探讨。因此，我们拟以电压门控钠离子通道，配体门控离子通道谷氨酸受体为模型，结合分子克隆技术，免疫荧光技术，FRAP/FLIP,蛋白电泳技术及电生理技术等系统分析其内质网滞留的分子机制，发现新的内质网驻留/返流信号和/或关键结构域，然后通过双相蛋白电泳技术，质谱分析等筛选参与其内质网质量控制相关的关键作用蛋白，提出内质网质量控制新的分子模型；并进一步探讨炎性因子和各信号途径对电压门控钠离子通道，谷氨酸受体内质网质量控制及内质网驻留/返流信号的调节作用。离子通道和受体的内质网质量控制机制研究技术途径示意图离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制神经元的轴突和树突是神经元与神经元相互信息传递及感受外界化学和物理信息的最主要的部位，主要负责信息感受的离子通道和受体在神经元的胞体合成后，要通过囊泡转运到细胞膜，这些囊泡更要通过轴浆运输的方式向轴突和树突转运（正向运输），插入到轴突和树突的细胞膜上，介导神经元的信息加工过程。同时，神经末梢的一些受体在受到其激动剂的作用后被激活，进入内吞小体的囊泡状结构，经轴浆运输的方式将信号传递到胞体（逆向运输），影响神经元中一些基因的表达调控，从而调节神经元的功能。目前，在离子通道/受体转运的囊泡类型、转运模式、蛋白序列的结构基础、相互作用蛋白和调控机制方面远未阐述清楚。因此，本研究将以电压门控的钠离子通道和钙离子通道、配体门控的离子通道（谷氨酸受体、P2X3受体和TRPV1受体）等的囊泡转运作为切入点，利用分子克隆、神经元培养和转染、活细胞成像技术动态描述离子通道/受体转运的囊泡类型和转运模式，采用囊泡分离、免疫共沉淀和质谱等方法和技术鉴定与转运环节相关的蛋白质复合物组分及相互作用，用基因过表达和沉默方法区分相互作用蛋白对离子通道/受体转运的重要性，结合基因定点突变和删减筛选决定离子通道和受体囊泡分选的分子内部信号和相互作用蛋白的结构基础，选择不同外界信号刺激和信号通路激活模式观察分子内部信号和相互作用蛋白的关键结构域在调控离子通道/受体囊泡转运中的机制，重点关注马达蛋白和细胞骨架的磷酸化和乙酰化调控作用，最终加深离子通道/受体囊泡转运调控机制对神经元兴奋性和突触可塑性的理解。离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制研究技术途径示意图受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程及机制神经元受体/离子通道转运到细胞膜或突触部位是其感受胞外信号并发挥正常功能的必要条件，这种定向转运通常依赖于胞内复杂的蛋白质运输调控机制来完成。受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程的调控，依赖于受体分子中特定的结构序列以及一系列与能与该结构序列结合的分选蛋白质分子，这些分选分子与目的蛋白质中的特定序列相结合，帮助目的蛋白质定向转运。不同受体决定其膜表面和突触定位、内化及再循环过程的结构序列以及相对应的分选蛋白质分子各不相同，这也是不同神经元受体膜表面胞内定位及运输不同的原因，因此有必要全面地建立神经元受体胞内运输的结构与相互作用蛋白质的调控网络。因此，本研究将以谷氨酸受体、G蛋白偶联受体（甘丙肽受体和CCR2受体）及酪氨酸激酶受体（TrkB和ErbB受体）为研究对象，利用包括免疫共沉淀、液-质联用质谱技术、酵母双杂交等大规模筛选和鉴定等手段，系统地筛选蛋白质转运相关复合物，然后将应用包括免疫细胞化学染色、免疫电镜、实时动态荧光追踪、荧光相关光谱分析(FCS)、光漂白后荧光恢复术（FRAP）、荧光共振能量转移术 (FRET)、全内反射荧光显微术（TIRFM）等成像技术进行亚细胞定位和实时动态分析并结合基因操作、电生理和动物模型等技术对其进行深入的结构和功能研究，解析这些蛋白质分子是如何通过与相应受体中的特定结构域结合，调控受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程，进而影响到受体功能的执行，调控突触可塑性及神经信号的感知与传导。膜受体酪氨酸激酶受体G蛋白偶联受体离子型谷氨酸受体筛选、鉴定与膜受体相互作用的新蛋白质关键结构域鉴定基因突变/分子克隆内质网驻留/返流免疫细胞化学染色激光共聚焦成像技术膜表面和突触定位酵母双杂交/免疫共沉淀/质谱技术蛋白质动态转运机制内化和分拣细胞膜表面受体荧光或生物素标记技术蛋白质剪切加工调控降解再循环受体膜表面动态分布、亚细胞定位和功能活细胞荧光成像技术（FCS,FRET等）磷酸化蛋白剪切泛素化细胞兴奋性的调控及信号的感知电生理技术和药理学方法神经信息传导的调控受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程及机制研究技术途径示意图离子通道的膜转运与神经元兴奋性调控离子通道是神经信号的发生和中枢信息处理的基础。电压门控钠离子和钙离子通道作为可兴奋性细胞膜表面最重要的离子通道，其主要功能是形成动作电位，将细胞电活动转化为钙信号而激活其下游信号通路，从而构成了神经元的兴奋性，导致神经递质释放并产生一系列的胞内活动如细胞骨架、蛋白质产生、磷酸化和去磷酸化及细胞增殖。对于电压门控钠离子和钙离子通道的功能调控的研究，除了对其通道特性调控的研究外，细胞膜表面电压门控钠离子和钙离子通道通道转运插入到细胞膜数量的调控机制也是重要的研究方面，即其膜转运的调控。离子通道膜转运的调控可能与通道的结构、相关作用的分子、外界的调控因子和胞内的信号通路有关，对于与离子通道相互作用分子的研究以往多集中在其辅助亚基，对于其它相互作用分子的研究只局限于个别分子，有必要全面地建立离子通道复合物相互作用蛋白质的调控网络。该内容试图以电压门控的钠离子通道和钙离子通道的膜转运为切入点，结合生物化学、分子生物学、电生理学等多种研究方法，研究通道的定位、转运和内化等膜转运的不同环节对离子通道插入到细胞膜的数量的调控机制，并重点阐明其膜转运在初级感觉神经元兴奋性、中枢神经元兴奋性和突触传递中的功能和调节，从而为以电压门控钠离子和钙离子通道膜转运为靶点的特异性干预手段提供重要的理论基础。离子通道的膜转运与神经元兴奋性调控研究技术途径示意图受体膜转运磷酸化调节与突触可塑性谷氨酸受体在突触后胞浆及后膜间亚单位特异性的转运的动态变化是造成长时程增强及长时程抑制等可塑性现象的重要分子机制(Shi, et al, 1999;)。相对而言，NMDA受体转运的动态变化及其调控对突触可塑性的贡献还研究较少。因此，深入研究谷氨酸NMDA受体在突触后膜动态变化的调控以及与突触可塑性的关系具有重要的生物学意义。谷氨酸受体在突触后膜的动态变化受到包括酪氨酸激酶受体、酪氨酸磷酸酶以及支架蛋白等多种信号的调控。因此，本研究将以酪氨酸激酶受体TrkB、ErbB4、酪氨酸激酶受体EGFR/ErbB家族重要的信号调控元件酪氨酸磷酸酶Shp2和支架蛋白GABs以及CaMKII和PKC激酶为研究对象，利用蛋白质相互作用检测技术、基因操作、转基因动物模型、细胞膜表面受体荧光或生物素标记技术、活细胞荧光成像技术（FCS和FRET）等，观察它们对NMDA受体的突触后定位、上膜以及内化等动态转运过程的调控，并进一步运用药理学方法和电生理学技术探讨其对突触传递和突触可塑性的影响。蛋白质相互作用检测技术转基因动物模型干扰小肽药理学TrkB/ErbB4对话汇聚相互作用Shp2/GABs CaMKII PKC 受体介导的荧光素配体内化法生物素标记表面受体生化法电生理技术NMDA受体突触后定位/上膜/内化电生理技术突触可塑性 受体膜转运磷酸化调节与突触可塑性研究技术途径示意图四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1. 系统分析电压门控钠离子通道跨膜区段，谷氨酸受体的内质网驻留/返流信号，建立膜蛋白跨膜区的内质网驻留/返流信号的分子检测模型，发现新的内质网驻留/返流信号和关键结构域。2. 筛查、识别和鉴定氧化代谢紊乱引起的中枢神经系统内细胞未知因子或蛋白因子，尤其是细胞趋化因子。 3. 系统分析胞内信使、突触蛋白、各信号途径和胞外调控因子对受体或离子通道膜表面表达的影响。4. 用生物信息学和蛋白质组学，质谱分析等方法筛选参与囊泡或线粒体动态转运的相关蛋白数据库。5. 中枢神经系统海马Shp2/GABs条件性敲除动物模型的一般生理学与行为学观察，探讨磷酸酶Shp2/GABs信号缺失对海马神经元一般生理功能的影响1. 发现钠离子通道跨膜区段和谷氨酸受体的新的内质网驻留/返流信号。2. 证实细胞趋化因子是神经元调节脑内免疫反应的开关分子。3. 确定离子通道或受体轴浆转运，上膜的基本模式。揭示胞内信使、突触蛋白、各信号途径中关键蛋白和胞外调控因子对钙离子通道的细胞及亚细胞定位和分布的影响。4. 丰富参与囊泡和线粒体动态转运的膜蛋白数据库。5. 完成Shp2/GABs在海马区（CA1-CA4）分布、定位与时序表达差异（胚胎、新生、成年），完成Shp2/GABs敲除品系海马区神经元发生、分化及凋亡功能检测。第二年1. 建立筛选参与离子通道/受体内质网质量控制的关键相互作用蛋白方法，并用于关键相互作用蛋白筛选。2. 分析离子通道和受体在细胞膜上数量的改变对其通道电流、中枢神经元兴奋性变化和神经递质释放的贡献。3. 探讨SNARE，动力蛋白复合物及其它参与囊泡分选和融合的新的膜蛋白质在囊泡形成、分选、转运、融合、释放以及细胞器修复或周转中的作用。4. 在体内验证抗氧化剂对神经元在氧化应激情况下产生细胞趋化因子的调节作用。5. 利用海马神经元细胞株明确Shp2/GABs复合物在介导Neuregulin/ErbB4、BDGF/TrkB信号的磷酸化调控机制。以及Shp2信号调控神经递质受体的膜分布、突触定位与功能调控的影响1. 揭示胞内信使、突触蛋白、各信号途径中关键蛋白和胞外调控因子对离子通道或受体的电流、神经元兴奋性变化和神经递质释放的影响。2. 确定v-SNAREs和t-SNAREs，并鉴定新的相关膜蛋白质在囊泡形成、分选、转运、融合、释放以及细胞器修复或周转中的作用。发现在神经元中特异表达的动力蛋白中链不同亚型的分布；以及在囊泡和细胞器选择性转运中的功能及机理。3. 阐明细胞趋化因子调控脑内免疫/炎症反应的分子、细胞机制。第三年1. 进一步寻找钙离子通道，谷氨酸受体，ErbB4受体，Trk受体等分子内部决定转运的信号。同时，在已发现的信号序列的基础上，通过酵母双杂交，双向凝胶电泳，质谱分析等方法筛选与信号序列有相互作用的蛋白质。2. 分析胞内信使、突触蛋白和各信号途径对电压门控钙离子通道或者谷氨酸受体本身特性的影响及相应的电流变化、中枢神经元兴奋性的改变和神经递质释放的影响。3. 在整体水平（如转基因鼠）探讨相关蛋白质复合物在不同囊泡及细胞器的逆行转运和选择性调节相关机理及功能，阐明细胞趋化因子是介导氧化代谢紊乱引起的中枢神经系统免疫/炎症反应的关键分子，及其可能的机制。4. 在海马脑切片水平，检测Shp2基因敲除对海马LTP和LTD的影响。如有影响，将进一步结合药理学方法找寻其作用机制。5. 完成PICK1磷酸化对AMPA受体转运调控的研究，在此基础上选定另外目标蛋白，用同样方法研究目标蛋白的磷酸化。6. 总结前2年的实验，在总结过程中对实验方案有偏差部分做修正。1. 发现与离子通道相偶联的信号分子。2. 进一步确定细胞膜钙离子通道特性和数量的改变与神经元突触传递的关系。明确分别由CaMKII及PKC激活所诱导的LTP机制是否相同。3. 阐明不同囊泡及细胞器的逆行转运和选择性调节机制及细胞趋化因子在整体水平的功能及影响。4. 明确在体内SHP2对LTP，LTD的影响。5. 明确PICK1磷酸化对AM