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第一章 蛋白质化学 教学目标： 1.掌握蛋白质的概念、重要性和分子组成。 2.掌握-氨基酸的结构通式和20种氨基酸的名称、符号、结构、分类；掌握氨基酸的重要性质；熟悉肽和活性肽的概念。 3.掌握蛋白质的一、二、三、四级结构的特点及其重要化学键。 4.了解蛋白质结构与功能间的关系。 5.熟悉蛋白质的重要性质和分类 导入：100年前，恩格斯指出“蛋白体是生命的存在形式”；今天人们如何认识蛋白质的概念和重要性？ 第一节 蛋白质的分子组成 一、蛋白质的元素组成 经元素分析，主要有 C（50%55%）、H（6%7%）、O（19%24%）、N（13%19%）、S（0%4%）。有些蛋白质还含微量的P、Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、I等。 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。因此，可以用定氮法来推算样品中蛋白质的大致含量。 每克样品含氮克数6.25100=100g样品中蛋白质含量（g%） 二、蛋白质的基本组成单位氨基酸 蛋白质在酸、碱或蛋白酶的作用下，最终水解为游离氨基酸（amino acid），即蛋白质组成单体或构件分子。存在于自然界中的氨基酸有300余种，但合成蛋白质的氨基酸仅20种（称编码氨基酸），最先发现的是天门冬氨酸（1806年），最后鉴定的是苏氨酸（1938年）。 （一）氨基酸的结构通式 组成蛋白质的20种氨基酸有共同的结构特点： 1氨基连接在- C上，属于-氨基酸（脯氨酸为-亚氨基酸）。 2R是側链，除甘氨酸外都含手性C，有D-型和L-型两种立体异构体。天然蛋白质中的氨基酸都是L-型。 注意：构型是指分子中各原子的特定空间排布，其变化要求共价键的断裂和重新形成。旋光性是异构体的光学活性，是使偏振光平面向左或向右旋转的性质，（-）表示左旋，（+）表示右旋。构型与旋光性没有直接对应关系。 （二）氨基酸的分类 1按R基的化学结构分为脂肪族、芳香族、杂环、杂环亚氨基酸四类。 2按R基的极性和在中性溶液的解离状态分为非极性氨基酸、极性不带电荷、极性带负电荷或带正电荷的四类。 带有非极性R（烃基、甲硫基、吲哚环等，共9种）：甘（Gly）、丙（Ala）、缬（Val）、亮（Leu）、异亮（Ile）、苯丙（Phe）、甲硫（Met）、脯（Pro）、色（Trp） 带有不可解离的极性R（羟基、巯基、酰胺基等，共6种）：丝（Ser）、苏（Thr）、天胺（Asn）、谷胺（Gln）、酪（Tyr）、半（Cys） 带有可解离的极性R基（共5种）：天（Asp）、谷（Glu）、赖（Lys）、精（Arg）、组（His），前两个为酸性氨基酸，后三个是碱性氨基酸。 蛋白质分子中的胱氨酸是两个半胱氨酸脱氢后以二硫键结合而成，胶原蛋白中的羟脯氨酸、羟赖氨酸，凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋白质加工修饰而成。 （三）氨基酸的重要理化性质 1一般物理性质 -氨基酸为无色晶体，熔点一般在200 oC以上。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大（酪氨酸不溶于水）。一般溶解于稀酸或稀碱，但不能溶解于有机溶剂，通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 芳香族氨基酸（Tyr、Trp、Phe）有共轭双键，在近紫外区有光吸收能力，Tyr、Trp的吸收峰在280nm，Phe在265 nm。由于大多数蛋白质含Tyr、Trp残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。 2两性解离和等电点（isoelectric point, pI） 氨基酸在水溶液或晶体状态时以两性离子的形式存在，既可作为酸（质子供体），又可作为碱（质子受体）起作用，是两性电解质，其解离度与溶液的pH有关。 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势和程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。氨基酸的pI是由-羧基和-氨基的解离常数的负对数pK1和pK2决定的。计算公式为：pI=1/2(pK1+ pK2)。 若1个氨基酸有3个可解离基团，写出它们电离式后取兼性离子两边的pK值的平均值，即为此氨基酸的等电点（酸性氨基酸的等电点取两羧基的pK值的平均值，碱性氨基酸的等电点取两氨基的pK值的平均值）。 3氨基酸的化学反应 氨基酸的化学反应是其基团的特征性反应。重要的有： （1）茚三酮反应 所有具有自由-氨基的氨基酸与过量茚三酮共热形成蓝紫色化合物（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质）。用分光光度法可定量测定微量的氨基酸。蓝紫色化合物的最大吸收峰在570nm波长处，黄色在440nm波长下测定。吸收峰值的大小与氨基酸释放的氨量成正比。 （2）与2，4-二硝基氟苯（DNFB）的反应 在弱碱性溶液中，氨基酸的-氨基很容易与DNFB作用生成稳定的黄色2，4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸），这一反应在蛋白质化学的研究史上起过重要作用，Sanger等人应用它测定胰岛素一级结构。 多肽顺序自动分析仪是根据相类似的原理设计的，即利用多肽链N端氨基酸的-氨基与异硫氰酸苯酯PITC反应（Edman降解法）。 三、肽（peptide） 1肽键与肽链 一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水形成的酰胺键称为肽键。由氨基酸通过肽键相连而成的化合物称为肽。肽键及其两端的-碳原子相连所形成的长链骨架，即CCNCCNCCNC称为多肽主链，CCN是重复单位。肽键是蛋白质分子中的主要共价键。多肽链的方向性是从N末端指向C末端。 肽分子中不完整的氨基酸称为氨基酸残基。肽按其序列从N端到C端命名。一般10肽以下属寡肽，10肽以上为多肽。 2生物活性肽 （1）谷胱甘肽（glutathione，GSH） 是由Glu、Cys、Gly组成的一种三肽，又叫-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸（含-肽键）。Cys的-SH是主要功能基团，GSH是一种抗氧化剂，是某些酶的辅酶，可保护蛋白质分子中的-SH免遭氧化，保护巯基蛋白和酶的活性。在GSH过氧化物酶的作用下，GSH还原细胞内产生的H2O2，生成H2O，2分子GSH被氧化成GSSG，后者在GSH还原酶催化下，又生成GSH。 （2）多肽类激素和神经肽 人体内有许多激素属寡肽或多肽，如下丘脑垂体分泌的催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（ACTH，39肽）等。催产素和加压素结构仅第3、第8位两个氨基酸残基不同，前者使平滑肌收缩，有催产和使乳腺泌乳的作用；后者能使小动脉收缩，增高血压，也有减少排尿的作用。 神经肽是在神经传导过程中起信号转导作用的肽类。如脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。随着脑科学的发展，会发现更多的生物活性肽。 第二节 蛋白质的分子结构 蛋白质是生物大分子，结构比较复杂，人们用4个层次来描述，包括蛋白质的一级、二级、三级和四级结构。一级结构描述的是蛋白质的线性（或一维）结构，即共价连接的氨基酸残基的序列，又称初级或化学结构。二级以上的结构称高级结构或构象（conformation）。 一、蛋白质的一级结构（primary structure） 1953年，英国科学家F. Sanger首先测定了胰岛素（insulin）的一级结构，有51个氨基酸残基，由一条A链和一条B链组成，分子中共有3个二硫键，其中两个在A、B链之间，另一个在A链内。 蛋白质的一级结构测定或称序列分析常用的方法是Edman降解和重组DNA法。Edman降解是经典的化学方法，比较复杂。首先要纯化一定量的待测蛋白质，分别作分子量测定、氨基酸组成分析、N-末端分析、C-末端分析；要应用不同的化学试剂或特异的蛋白内切酶水解将蛋白质裂解成大小不同的肽段，测出它们的序列，对照不同水解制成的两套肽段，找出重叠片段，最后推断蛋白质的完整序列。重组DNA法是基于分子克隆的分子生物学方法，比较简单而高效，不必先纯化该种蛋白质，而是先要得到编码该种蛋白质的基因（DNA片段），测定DNA中核苷酸的序列，再按三个核苷酸编码一个氨基酸的原则推测蛋白质的完整序列。这两种方法可以相互印证和补充。 目前，国际互联网蛋白质数据库已有3千多种一级结构清楚。蛋白质一级结构是空间结构和特异生物学功能的基础二、蛋白质的二级结构（secondary structure） 蛋白质的二级结构是指其分子中主链原子的局部空间排列，是主链构象（不包括侧链R基团）。 构象是分子中原子的空间排列，但这些原子的排列取决于它们绕键的旋转，构象不同于构型，一个蛋白质的构象在不破坏共价键情况下是可以改变的。但是蛋白质中任一氨基酸残基的实际构象自由度是非常有限的，在生理条件下，每种蛋白质似乎是呈现出称为天然构象的单一稳定形状。 20世纪30年代末，L.Panling 和R.B.Corey应用X射线衍射分析测定了一些氨基酸和寡肽的晶体结构，获得了一组标准键长和键角，提出了肽单元（peptide unit）的概念, 还提出了两种主链原子的局部空间排列的分子模型（-螺旋）和（-折叠）。 1肽单位 肽键及其两端的-C共6个原子处于同一平面上，组成了肽单位（所在的平面称肽键平面）。 肽键CN键长为0.132nm，比相邻的单键（0.147nm）短，而较C=N双键（0.128nm）长，有部分双键的性质，不能自由旋转。肽键平面上各原子呈顺反异构关系，肽键平面上的O、H以及2个-碳原子为反式构型（trans configuration）。 主链中的CC和CN单键可以旋转，其旋转角、决定了两个相邻的肽键平面相对关系。由于肽键平面的相对旋转，使主链可以以非常多的构象出现。事实上，肽链在构象上受到很大限制，因为主链上有1/3不能自由旋转的肽键，另外主链上有很多侧链R的影响。蛋白质的主链骨架由许多肽键平面连接而成。 2.-螺旋(-helix) -螺旋是肽键平面通过-碳原子的相对旋转形成的一种紧密螺旋盘绕，是有周期的一种主链构象。其特点是： 螺旋每转一圈上升3.6个氨基酸残基，螺距约0.54nm（每个残基上升0.15nm，旋转100O）。 相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。典型-螺旋一对氢键O与N之间共有13个原子（3.613），前后间隔3个残基。 螺旋的走向绝大部分是右手螺旋，残基侧链伸向外侧。R基团的大小、荷电状态及形状均对-螺旋的形成及稳定有影响。 3.-折叠(-pleated sheet) -折叠是一种肽链相当伸展的周期性结构。 相邻肽键平面间折叠成110O角，呈锯齿状。 两个以上具-折叠的肽链或同一肽链内不同肽段相互平行排列，形成-折叠片层，其稳定因素是肽链间的氢键。 逆向平行的片层结构比顺向平行的稳定。 -螺旋和-折叠是蛋白质二级结构的主要形式。毛发中的-角蛋白和蚕丝中的丝心蛋白是其典型，在许多球蛋白中也存在，但所占比例不一样。 胶原蛋白中存在的螺旋结构不同于一般的-螺旋，是由3条具有左手螺旋的链相互缠绕形成右手超螺旋分子。链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其稳定性。 4-转角（-turn） 为了紧紧折叠成球蛋白的紧密形状，多肽链180O回折成发夹或-转角。其处由4个连续的氨基酸残基构成，常有Gly和Pro存在，稳定-转角的作用力是第一个氨基酸残基羰基氧（O）与第四个氨基酸残基的氨基氢（H）之间形成的氢键。-转角常见于连接反平行-折叠片的端头。 5无规卷曲（random coil） 多肽链的主链呈现无确定规律的卷曲。典型球蛋白大约一半多肽链是这样的构象。 6超二级结构和结构域 超二级结构和结构域是蛋白质二级至三级结构层次的一种过渡态构象。 超二级结构指蛋白质中两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一特殊的组合体，又称为模体（motif）。通常有，等，例如钙结合蛋白质中的螺旋-环-螺旋模序及锌指结构。 结构域是球状蛋白质的折叠单位，是在超二级结构基础上进一步绕曲折叠有独特构象和部分生物学功能的结构。对于较小的蛋白质分子或亚基，结构域和三级结构是一个意思，即这些蛋白质是单结构域的；对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上的相对独立的结构域缔合成三级结构。 三、蛋白质的三级结构（tertiary structure） 指一条多肽链中所有原子的整体排布，包括主链和侧链。维系三级结构的作用力主要是次级键（疏水相互作用、静电力、氢键等）。在序列中相隔较远的氨基酸疏水侧链相互靠近，形成“洞穴”或“口袋”状结构，结合蛋白质的辅基往往镶嵌其内，形成功能活性部位，而亲水基团则在外，这也是球状蛋白质易溶于水的原因。1963年Kendrew等从鲸肌红蛋白的X射线衍射图谱测定它的三级结构（153个氨基酸残基和一个血红素辅基，相对分子质量为17800）。由AH 8段-螺旋盘绕折叠成球状，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部形成一个袋形空穴，血红素居于其中，富有极性及电荷的则在分子表面形成亲水的球状蛋白。 四、蛋白质的四级结构 (quaternary structure) 有些蛋白质的分子量很大，由2条或2条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成，称为蛋白质的四级结构。构成四级结构的每条多肽链称为亚基 (subunit)，亚基单独存在时一般没有生物学功能，构成四级结构的几个亚基可以相同或不同。如血红蛋白(hemoglobin,Hb) 是由两个-亚基和两个-亚基形成的四聚体（22）。 五、蛋白质分子中的化学键 ，蛋白质的一级结构是由共价键形成的，如肽键和二硫键。而维持空间构象稳定的是非共价的次级键。如氢键、盐键、疏水键、范德华引力等。 第三节 蛋白质结构与功能的关系 一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一）一级结构是空间构象的基础 20世纪60年代初，美国科学家C.Anfinsen进行牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验，提出了蛋白质一级结构决定空间结构的命题。 核糖核酸酶由124个氨基酸残基组成，有4对二硫键。用尿素和-巯基乙醇处理该酶溶液，分别破坏次级键和二硫键，肽链完全伸展，变性的酶失去催化活性；当用透析方法去除变性剂后，酶活性几乎完全恢复，理化性质也与天然的酶一样。 概率计算表明，8个半胱氨酸残基结合成4对二硫键，可随机组合成105种配对方式，而事实上只形成了天然酶的构象，这说明一级结构未破坏，保持了氨基酸的排列顺序就可能回复到原来的三级结构，功能依然存在。 （二）种属差异 大量实验结果证明，一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间结构和功能也相似，不同种属的同源蛋白质有同源序列，反映其共同进化起源，通过比较可以揭示进化关系。 例如哺乳动物的胰岛素，其一级结构仅个别氨基酸差异（A链5、6、10位，B链30位），它们对生物活性调节糖代谢的生理功能不起决定作用。 从各种生物的细胞色素C(cytochrome c ) 的一级结构分析，可以了解物种进化间的关系。进化中越接近的生物，它们的细胞色素c的一级结构越近似。 （三）分子病 分子病是指机体DNA分子上基因缺陷引起mRNA分子异常和蛋白质生物合成的异常，进而导致机体某些功能和结构随之变异的遗传病。在1904年，发现镰刀状红细胞贫血病。大约化费了40多年才清楚患病原因，患者的血红蛋白（HbS）与正常人的（HbA）相比，仅-链的第6位上，Val取代了正常的Glu。目前全世界已发现有异常血红蛋白400种以上。 二、蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础，空间结构变化，其功能也随之改变。肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是典型的例子。 肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进行可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb是四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它们的氧合曲线不同，Mb为一条双曲线，Hb是一条 S型曲线。在低p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白对氧亲和性高很多，p(O2)为2.8torr(1torr133.3Pa)时，肌红蛋白处于半饱和状态。在高p(O2)下，如在肺部（大约100torr）时，两者几乎都被饱和。其差异形成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。 Hb未与氧结合时，其亚基处于一种空间结构紧密的构象（紧张态，T型），与氧的亲和力小。只要有一个亚基与氧结合，就能使4个亚基间的盐键断裂，变成松弛的构象（松弛态，R型）。T型和R型的相互转换对调节Hb运氧的功能有重要作用。一个亚基与其配体结合后能促进另一亚基与配体的结合是正协同效应，其理论解释是Hb是别构蛋白，有别构效应。 第四节 蛋白质的理化性质 蛋白质的理化性质和氨基酸相似，有两性解离及等电点、紫外吸收和呈色反应。作为生物大分子，还有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。要了解和分析蛋白质结构和功能的关系就要利用其特殊的理化性质，采取盐析、透析、电泳、层析及离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法分离纯化蛋白质。 一、蛋白质的高分子性质 蛋白质的相对分子质量在1万100万，其颗粒平均直径约为4.3 nm（胶粒范围是1100nm）。准确可靠的测定方法是超离心法，蛋白质的相对分子质量可用沉降系数（S）表示。 在球状蛋白质三级结构形成时，亲水基团位于分子表面，在水溶液中与水起水合作用，因此，蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质。颗粒表面的水化膜和电荷是其稳定的因素，调节pH至pI、加入脱水剂等，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。 透析法是利用蛋白质不能透过半透膜的性质，去掉小分子物质，达到纯化的目的。 大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开。又称分子筛层析。 二、蛋白质的两性解离 蛋白质和氨基酸一样是两性电解质，在溶液中的荷电状态受pH值影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。pHpI时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。在人体体液中多数蛋白质的等电点接近pH5，所以在生理pH7.4环境下，多数蛋白质解离成阴离子。少量蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白的pI偏于碱性，称碱性蛋白质，而胃蛋白酶和丝蛋白为酸性蛋白。 三、蛋白质的变性、沉淀和凝固 蛋白质在某些理化因素的作用下，空间结构被破坏，导致理化性质改变，生物学活性丧失，称为蛋白质的变性（denaturation）。 蛋白质变性的本质是多肽链从卷曲到伸展的过程，不涉及一级结构的改变（如加热破坏氢键，酸碱破坏盐键等）。变性作用不过于剧烈，是一种可逆反应，去除变性因素，有些蛋白质原有的构象和功能可恢复或部分恢复，称为复性（denaturation）。 蛋白质变性的主要表现是失去生物学活性，如酶失去催化能力、血红蛋白失去运输氧的功能、胰岛素失去调节血糖的生理功能等。变性蛋白溶解度降低，易形成沉淀析出；易被蛋白水解酶消化。蛋白质变性具有重要的实际意义。 蛋白质自溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。盐析、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂都可沉淀蛋白质。盐析沉淀蛋白质不变性，是分离制备蛋白质的常用方法。如血浆中的清蛋白在饱和的硫酸铵溶液中可沉淀，而球蛋白则在半饱和硫酸铵溶液中发生沉淀。乙醇、丙酮均为脱水剂，可破坏水化膜，降低水的介电常数，使蛋白质的解离程度降低，表面电荷减少，从而使蛋白质沉淀析出。低温时，用丙酮沉淀蛋白质，可保留原有的生物学活性。但用乙醇，时间较长则会导致变性。重金属盐（Hg2+、Cu2+、Ag+），生物碱（如三彔乙酸、苦味酸、鞣酸）与蛋白质结合成盐而沉淀，是不可逆的。 蛋白质变性不一定沉淀（如强酸、强碱作用变性后仍然能溶解于强酸、强碱溶液中，将pH调至等电点，出现絮状物，仍可溶解于强酸、强碱溶液，加热则变成凝块，不再溶解）。凝固是蛋白质变性发展的不可逆的结果。沉淀的蛋白质不一定变性（如盐析）。 四、蛋白质的紫外吸收和呈色反应 蛋白质含芳香族氨基酸，在280nm波长处有特征性吸收峰，用于定量测定。 蛋白质分子中的多种化学基团具有特定的化学性能，与某些试剂产生颜色反应，可用于定性、定量分析。如蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，在碱性溶液与硫酸铜反应产生红紫色络合物（双缩脲反应）。酪氨酸含酚基，与米伦试剂生成白色沉淀，加热后变红色。Folin-酚试剂与酪氨酸反应生成蓝色。色氨酸与乙醛酸反应，慢慢注入浓硫酸，出现紫色环。 第五节 蛋白质的分类 自然界蛋白质分布广泛，种类繁多，有10121013种。目前仍无法按蛋白质的化学结构进行精确的分类，一般按蛋白质的分子形状、分子组成、生物功能进行分类。 1按分子形状分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。 2按分子组成分为简单蛋白质和结合蛋白质。 简单蛋白质完全水解的产物仅为-氨基酸。这类蛋白质按其溶解度等理化性质分为7类。包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白和硬蛋白。 结合蛋白质由简单蛋白质和非蛋白质（辅基）组成。根据辅基的不同，这类蛋白质可分为5类。如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和磷蛋白。 细胞核中的核蛋白是DNA与组蛋白结合而成，细胞质中的核糖体是RNA与蛋白质组成的，已知的病毒也是核蛋白。免疫球蛋白是一类糖蛋白，由蛋白质与糖以共价键相连而成；脂蛋白由蛋白质与脂类通过非共价键相连，存在生物膜和动物血浆中。 3按蛋白质功能分为活性蛋白质和非活性蛋白质。 活性蛋白质包括有催化功能的酶、有调节功能的激素、有运动、防御、接受和传递信息的蛋白质以及毒蛋白、膜蛋白等。胶原、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等是非活性蛋白质。 酶原的生物合成和酶原激活一般不在同一组织、细胞或细胞器中进行。酶原的激活具有重要的生理意义，不仅保护细胞本身不受酶的水解破坏，而且保证酶在特定的部位与环境中发挥催化作用。 第三章 酶 教学目标： 1掌握酶的概念和作用特点，了解酶的分类与命名。 2熟悉酶的分子组成、结构与功能（单纯酶和结合酶，酶的辅因子、维生素的类别与功能，酶的活性部位，酶原激活，同工酶、变构酶和抗体酶）。 3熟悉酶的作用机制。 4熟悉影响酶促反应的因素（酶浓度、底物浓度、温度、pH、激活剂与抑制剂；掌握酶促反应速度的表示、米氏方程和米氏常数的意义）。 5了解酶的制备与应用。 第一节 概 论 导入：酶学知识来源于生产与生活实践。我们祖先很早就会制酱和酿酒。西方国家于1810年发现酵母可将糖转化为酒精；1833年，Payen及Persoz从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种热不稳定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德国科学家屈内（Kuhne）首先把这类物质称为酶（enzyme，其意“在酵母中” ）。1860年法国科学家巴斯德（Pasteur）认为发酵是酵母细胞生命活动的结果，细胞破裂则失去发酵作用。1897年，Buchner兄弟首次用不含细胞的酵母提取液实现了发酵，证明发酵是酶作用的化学本质，获得1911年诺贝尔化学奖。1926年，美国生化学家Sumner第一次从刀豆得到脲酶结晶，并证明是蛋白质。1930年，Northrop得到胃蛋白酶的结晶（1946年二人共获诺贝尔化学奖）。1963年测定第一个牛胰RNaseA序列（124aa）；1965年揭示卵清溶菌酶的三维结构（129aa）。 一、酶的概念 酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂（biocatalyst）。已发现的有两类：主要的一类是蛋白质酶（enzyme），生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。美国科学家Cech于1981年在研究原生动物四膜虫的RNA前体加工成熟时发现核酶“ribozyme”，为数不多，主要做用于核酸（1989年的诺贝尔化学奖）。 二、酶的作用特点 酶所催化的反应称为酶促反应。在酶促反应中被催化的物质称为底物，反应的生成物称为产物。酶所具有的催化能力称为酶活性。 酶作为生物催化剂，具有一般催化剂的共性，如在反应前后酶的质和量不变；只催化热力学允许的化学反应，即自由能由高向低转变的化学反应；不改变反应的平衡点。但是，酶是生物大分子，又具有与一般催化剂不同的特点。 1极高的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。例如，脲酶催化尿素的水解速度是H+催化作用的71012倍；碳酸酐酶每一酶分子每秒催化6105 CO2与水结合成H2CO3，比非酶促反应快107倍。 2高度的特异性 酶对催化的底物有高度的选择性，即一种酶只作用一种或一类化合物，催化一定的化学反应，并生成一定的产物，这种特性称为酶的特异性或专一性。有结构专一性和立体异构专一性两种类型。 结构专一性又分绝对专一性和相对专一性。前者只催化一种底物，进行一种化学反应。如脲酶仅催化尿素水解。后者可作用一类化合物或一种化学键。如酯酶可水解各种有机酸和醇形成的酯。在动物消化道中几种蛋白酶专一性不同，胰蛋白酶只水解Arg或Lys羧基形成的肽键；胰凝乳蛋白酶水解芳香氨基酸及其它疏水氨基酸羧基形成的肽键。 立体异构专一性指酶对底物立体构型的要求。例如乳酸脱氢酶催化L-乳酸脱氢为丙酮酸，对D-乳酸无作用；L-氨基酸氧化酶只作用L-氨基酸，对D-氨基酸无作用。 3酶活性的可调节性 酶促反应受多种因素的调控，通过改变酶的合成和降解速度可调节酶的含量；酶在胞液和亚细胞的隔离分布构成酶的区域化调节；代谢物浓度或产物浓度的变化可以抑制或激活酶的活性；激素和神经系统的信息，可通过对关键酶的变构调节和共价修饰来影响整个酶促反应速度。所以酶是催化剂又是代谢调节元件，酶水平的调节是代谢调控的基本方式。 4酶的不稳定性 酶主要是蛋白质，凡能使蛋白质变性的理化因素均可影响酶活性，甚至使酶完全失活。酶催化作用一般需要比较温和的条件（37、1atm、pH7）。 三、酶的分类与命名 （一）酶的分类 根据国际酶学委员会（International Enzyme Commission，IEC）的规定，按照酶促反应的性质，分为六大类： 1氧化还原酶（oxidoreductases）催化底物进行氧化还原反应。如乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。 2转移酶（transferases）催化底物之间某些基团的转移或交换。如甲基转移酶、氨基转移酶、磷酸化酶等。 3水解酶（hydrolases）催化底物发生水解反应。如淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。 4裂解酶（lyases）催化底物裂解或移去基团（形成双键的反应或其逆反应）。如碳酸酐酶、醛缩酶、柠檬酸合成酶等。 5异构酶(isomerases) 催化各种同分异构体之间相互转化。如磷酸丙糖异构酶、消旋酶等。 6合成酶(ligases) 催化两分子底物合成一分子化合物，同时偶联有ATP的分解释能。如谷氨酰胺合成酶、氨基酸-RNA连接酶等。 （二）酶的命名 1961年，国际酶学委员会(IEC)主要根据酶催化反应的类型,把酶分为6大类，制定了系统命名法。规定每一酶只有一个系统名称，它标明酶的所有底物与催化反应性质，底物名称之间以“：”分隔，同时还有一个由4个数字组成的系统编号。如谷丙转氨酶的系统名称是丙氨酸：- 酮戊二酸氨基转移酶（酶表中的统一编号是EC2.6.1.2）。乳酸脱氢酶的编号是EC1.1.1.27。 第二节 酶的分子组成、结构和功能 一、酶的分子组成 （一）单纯酶和结合酶 单纯酶是仅由肽链构成的酶。如脲酶、一些消化蛋白酶、淀粉酶、脂酶、核糖核酸酶等。 结合酶由蛋白质部分和非蛋白质部分组成，前者称为酶蛋白(apoenzyme)，决定酶的特异性和高效率；后者称为辅助因子(cofactor)，决定反应的种类和性质。两者结合形成的复合物称为全酶（holoenzyme），这两部分对于催化活性都是必需的。 酶蛋白有单条肽链和多个亚基组成的。前者称为单体酶，为数不多，均为水解酶，如胰蛋白酶、核糖核酸酶、溶菌酶等；多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶称为寡聚酶，如磷酸化酶a，3-磷酸甘油醛脱氢酶等。 细胞内存在着许多由几种不同功能的酶彼此嵌合形成的多酶复合体，即多酶体系，它利于一系列反应的连续进行，如丙酮酸脱氢酶体系、脂肪酸合成酶复合体。在多酶体系中，能影响整条代谢途径方向和速度的酶称为关键酶，关键酶通常催化单向不平衡反应，或者是该多酶体系中催化活性最低的限速酶。 （二）酶的辅因子 酶的辅助因子指金属离子或小分子有机化合物（又称辅酶与辅基）。 1.金属离子 约2/3的酶含有金属离子，常见的是K+、Na+、Mg2+、Cu2+（Cu+）、Zn2+、Fe2+（Fe3+）等。金属离子的作用是多方面的：参与酶的活性中心；在酶蛋白与底物之间起桥梁作用；维持酶分子发挥催化作用所必需的构象；中和阴离子，降低反应中的静电斥力。 2.辅酶与辅基 辅酶与辅基是一些化学稳定的小分子有机物，是维生素样的物质，参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。 辅酶与酶蛋白的结合疏松，可以用透析或超滤方法除去；辅基则与酶蛋白结合紧密，不能用上述方法除去。一种酶蛋白只能与一种辅助因子结合成一种特异的酶，但一种辅助因子可以与不同的酶蛋白结合构成多种特异性酶，以催化各种化学反应。 维生素（Vitamin）是维持机体正常生命活动所必需的一类小分子有机物，基本不能在体内合成，即使有几种能自行合成，也因合成量不足而必须从食物中摄取。维生素的需要量及缺乏症是营养学的课题。 维生素原意是“生命中必不可少的胺”，波兰学者凡克把从米糠中提取出治疗脚气病有效的成分命名为维生素，现已发现13种，按溶解性分为水溶性和脂溶性两大类。脂溶性维生素以独立发挥作用为主，A、D、E、K具有一些特殊的生理功能。 以下8种水溶性的维生素都以辅酶的形式参与结合酶的组成。也有些本身就是辅酶，如硫辛酸、抗坏血酸。 含维生素的辅酶及其主要功能 维生素 辅酶形式 反应类型 硫胺素（B1） 焦磷酸硫胺素（TPP） -酮酸氧化脱羧反应 核黄素（B2） 黄素单核苷酸（FMN） 黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD） 氧化还原反应 烟酸或烟酰胺（PP） 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+） 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+） 氧化还原反应 泛酸 辅酶A（CoA-SH） 酰基转移反应 吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺（B6） 磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺 转氨基作用、脱羧作用 生物素 生物胞素 CO2的固定 叶酸 四氢叶酸 一碳单位转移 钴胺素（B12） 5- 脱氧腺苷钴胺素 甲钴胺素 1，2 -氢原子转移 甲基转移 二、酶的活性部位 酶的活性部位（active site）是它结合底物和将底物转化为产物的区域，又称活性中心。它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维小区（为裂缝或为凹陷）。酶活性部位的基团属必需基团，有二种：一是结合基团，其作用是与底物结合，生成酶-底物复合物；二是催化基团，其作用是影响底物分子中某些化学键的稳定性，催化底物发生化学反应并促进底物转变成产物，也有的必需基团同时有这两种功能。还有一些化学基团位于酶的活性中心以外的部位，为维持酶活性中心的构象所必需，称为酶活性中心以外的必需基团。 构成酶活性中心的常见基团有组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基等。如丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶，都催化蛋白质的肽键使之水解，但底物的专一性由它们的底物-结合部位中氨基酸基团的性质所决定，与其作用的底物互补。像胰蛋白酶，在它的底物-结合部位有带负电荷的Asp残基，可与底物侧链上带正电荷的Lys和Arg相互作用，切断其羧基侧；胰凝乳蛋白酶在它的底物-结合部位有带小侧链的氨基酸残基，如Gly和Ser，使底物庞大的芳香的和疏水氨基酸残基得以进入，切断其羧基側；弹性蛋白酶有相对大的Val和Thr不带电荷的氨基酸側链，凸出在它的底物-结合部位，阻止了除Ala和Gly小側链以外的所有其他氨基酸。 三、酶原激活 没有活性的酶的前体称为“酶原”，酶原转变成酶的过程称为酶原激活。其实质是酶活性部位形成或暴露的过程。一些与消化作用有关的酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶在最初合成和分泌时，没有催化活性。胃蛋白酶原在H+作用下，自N端切下几个多肽碎片，形成酶催化所需的空间结构，转化为胃蛋白酶。胰蛋白酶原随胰液进入小肠时被肠激酶激活，自N端切除一个6肽，促使酶的构象变化，形成活性中心，转变成有活性的胰蛋白酶。 酶原的生物合成和酶原激活一般不在同一组织、细胞或细胞器中进行。酶原的激活具有重要的生理意义，不仅保护细胞本身不受酶的水解破坏，而且保证酶在特定的部位与环境中发挥催化作用。四、同工酶、变构酶、抗体酶 （一）同工酶（isozymes） 具有不同的分子形式但却催化相同的化学反应的一组酶称为同工酶。1959年发现的第一个同工酶是乳酸脱氢酶（LDH），它在NADH存在下，催化丙酮酸的可逆转化生成乳酸。它是一个寡聚酶，由两种不同类型的亚基组成5种分子形式：H4、H3M、H2M2、HM3、M4，它们的分子结构、理化性质和电泳行为不同，但催化同一反应，因为它们的活性部位在结构上相同或非常相似。M亚基主要存在骨骼肌和肝脏，而H亚基主要在心肌。心肌梗死的情况可通过血液LDH同工酶的类型的检测确定。 （二）变构酶(allosteric enzyme) 变构酶又称别构酶，是一类调节代谢反应的酶。一般是寡聚酶，酶分子有与底物结合的活性部位和与变构剂非共价结合的调节部位，具有变构效应。引起变构效应的物质称为变构效应剂。降低酶活性的称变构抑制剂或负效应物；反之，称为变构激活剂或正效应物。变构酶与血红蛋白一样，存在着协同效应。 变构酶催化的反应速度与底物浓度的关系常呈S形曲线，这和非调节酶的动力学曲线双曲线不同。变构酶多为限速酶。在多酶体系，限速酶一般位于代谢途径的起点或分支点上，对控制反应总速度起关键作用。如异柠檬酸脱氢酶就是一个变构酶，是三羧酸循环的关键酶，NAD+、ADP和柠檬酸是该酶的变构激活剂，而NADH和ATP是变构抑制剂。 （三）抗体酶（abzyme） 既是抗体又具有催化功能的蛋白质称为“抗体酶或催化性抗体”，其本质是免疫球蛋白，但是在易变区赋予了酶的属性。1986年科学家根据过渡态理论和免疫学原理，运用单克隆抗体技术成功地制备了具有酶活性的抗体。这加深了人们对酶作用原理的理解，而且在临床医学及制药业等方面有很好的应用。 第三节 酶的作用机制 一、酶的催化本质 现代化学反应速度理论是过渡态理论。在一个化学反应体系中，反应物从“初态” 到“过渡态”，转变成产物即到达“终态”。“过渡态”是底物分子被激活的不稳定态，不同于反应中间物，它具有最高能量，又处在一个短暂的分子瞬间，某些化学键正在断裂和形成并达到能生成产物或再返回生成反应物的程度。 酶催化的反应速度快是降低反应的能垒，即降低底物分子所必须具有的活化能。催化和非催化反应，其反应物和产物间总的标准自由能差是一样的。 二、中间产物学说和诱导契合学说 酶的作用机制包含酶如何同底物结合以及怎样加快反应速度两个内容。 20世纪初和40年代，科学家就提出了酶-底物复合物的形成和过渡态概念，即E+S ES E+P。酶和底物形成中间产物的学说已为实验所证实，且分离到若干种ES结晶。 已有两种模型解释酶如何结合它的底物。1894年Fischer提出锁和钥匙模型，底物的形状和酶的活性部位彼此相适合，这是一种刚性的和固定的组合。1958年Koshland提出诱导契合模型，底物的结合在酶的活性部位诱导出构象变化；酶也可使底物变形，迫使其构象近似于它的过渡态。这种作用是相互诱导、相互变形、相互适应的柔性过程。 酶的诱导契合 三、影响酶催化效率的因素 酶促反应高效率的原因常常是多种催化机制的综合应用，除酶-底物结合的诱导契合假说外，还有： （一）邻近效应与定向排列 在两个以上底物参与的反应中，由于酶的作用，底物被聚集到酶分子表面，彼此相互靠近并形成正确的定向关系，大大提高了底物的局部浓度，底物被催化的部位定向地对准酶的活性中心，实际上是将分子间的反应变成类似于分子内的反应，从而大大提高催化效率。 （二） 多元催化 酶分子中含有多种不同功能基团，如氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基等。既可作质子供体，又可作质子受体，使同一酶分子常可起广义酸催化和碱催化；即可起亲核催化，又可起亲电子催化。这些因素并不是在所有的酶中同时都一样的起作用，对不同的酶起主要作用的因素不完全相同。 第四节 酶促反应动力学 酶促反应动力学是研究酶促反应的速率和影响此速率的各种因素的科学。 一、酶反应速度的测量 反应的速率也称速度（velocity），是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。测定酶反应速度时，一般要求非常高的底物浓度以使实验测定的起始反应速率与酶浓度成正比。以产物的生成量对时间作图，绘制反应过程曲线，不同时间的反应速度就是时间为不同值时曲线的斜率。通常采用反应的初速度Vo，即以零时点为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这一直线的斜率即等于Vo，这可以避免底物浓度因被消耗而相对降低以及反应物堆积等因素对反应速度的抑制作用。（产物出现的速率或底物消失速率可根据特殊波长下吸收光的变化用分光光度计测定。） 二、酶浓度对反应速度的影响 当研究某一因素对酶促反应速度的影响时，体系中的其他因素保持不变，而只变动所要研究的因素。 当底物浓度远大于酶浓度时，酶促反应速度与酶浓度的变化成正比。 三、底物浓度对酶反应速度的影响 （一）米-曼氏方程式 1913年，Michaelis和Menten根据中间产物学说进行数学推导，得出V与S的数学方程式，即米-曼氏方程式。1925年Briggs和Haldane提出稳态理论，对米氏方程做了一项重要的修正。 底物浓度对酶促反应速度的影响呈双曲线。当底物浓度较低时，V与S呈正比关系（一级反应）；随着S的增高，V的增加逐步减慢（混合级反应）；增到一定程度，V不再增加而是趋于稳定（零级反应）。 当S Km 时，v = Vmax S /Km，反应速度与底物浓度成正比；当S Km 时 ，vVmax，反应速度达到最大速度，再增加S也不影响V。 （二）Km的意义 1当V/v =2时, Km =S , Km是反应速率v等于最大速率V一半时的底物浓度，单位为摩尔/升（mol/L）。 2Km =K2+K3/K1，当K2 K3时，Km值可用来表示酶对底物的亲和力。Km值越小，酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。 3Km是酶的特征性常数，它只与酶的结构和酶所催化的底物有关，与酶浓度无关。 Km和Vmax可用图解法根据实验数据测出。通过测定在不同底物浓度下的Vo，再用1/Vo对1/S的双倒数作图，又称Lineweaver-BurK作图法，即取米氏方程式倒数形式。 四、pH对反应速度的影响 每一种酶只能在一定限度的pH范围内才表现活力，酶表现最大活力时的pH称为酶的最适pH。最适pH的微小偏离可使酶活性部位的基团离子化发生变化而降低酶的活性，较大偏离时，维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰，导致酶蛋白的变性。 酶的最适pH不是固定的常数，受酶的纯度、底物的种类和浓度、缓冲液的种类和浓度等的影响。一般酶的最适pH在48之间，植物和微生物体内的酶最适pH多在4.56.5,而动物体内的最适pH多在6.58，多在6.8左右。但也有例外，如胃蛋白酶最适pH为1.9，胰蛋白酶的最适pH为8.1, 肝精氨酸酶的最适pH为9.0。Vo对pH的关系图形是钟形曲线。 五、温度对反应速度的影响 温度对Vo关系的图形是一条曲线，它可清楚地表示出最适温度。多数哺乳动物的酶最适温度在37左右，植物体内酶的最适温度在5060。也有些微生物的酶适应在高温或低温下工作。温度从两方面影响酶促反应速率，是升高温度提高反应速率和酶遇热易变性失活两个相反效应间的平衡。 六、激活剂对反应速度的影响 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂（activator）。必需激活剂常是金属离子，如Mg2+、K+、Mn2+等, Mg2+是多种激酶和合成酶的必需激活剂；非必需激活剂是有机化合物和Cl-等，如胆汁酸盐是胰脂肪酶，Cl-是唾液淀粉酶的非必需激活剂。 七、抑制剂对反应速度的影响 使酶活性下降而不导致酶变性的物质称为酶的抑制剂。抑制剂作用有可逆和不可逆抑制两类。以可逆抑制最为重要。 （一） 不可逆抑制作用 这类抑制剂通常以共价键与酶活性中心上的必需基团相结合，使酶失活，一般不能用透析、超滤等物理方法去除。这类抑制作用可用某些药物解毒，使酶恢复活性。如农药敌百虫、敌敌畏、1059等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合，使酶失活，导致乙酰胆碱不能水解而积存。迷走神经兴奋呈现中毒状态。解磷定（PAM）可解除有机磷化合物对羟基酶的抑制作用，显然这类解毒药物和有机磷农药结合的强度大于和酶结合。重金属盐引起的巯基酶中毒，可用络合剂或加入其他过量的巯基化合物，如二巯基丙醇（BAL）来解毒。 （二） 可逆抑制作用 这类抑制剂通常以非共价键与酶可逆性结合，使酶活性降低或失活，采用透析、超滤的方法可去除抑制剂，恢复酶活性。可逆抑制有竞争、非竞争、反竞争3种类型，以竞争性抑制研究的最多。三种作用的共同点是因Km和Vmax值的变化导致酶促反应初速度下降。竞争性抑制剂的结构与底物类似，且在酶的同一部位（活性中心）和酶结合，仅在加大底物浓度时才逐渐抵消，显然Km值要增加，Vmax不变。非竞争性抑制剂不直接影响酶与底物的结合，酶同时和二者结合生成的中间产物是三元复合物，也无正常产物生成，所以Km不变，而Vmax减小。反竞争抑制剂促进酶与底物的结合，形成的三元复合物也不能形成正常产物，所以Km变小，Vmax也变小。 药物是酶的抑制剂。竞争性抑制原理应用范例是磺胺药的研制。磺胺药和细菌合成叶酸所需的对氨基苯甲酸仅一个碳原子之