青霉素发酵培训材料2.doc

青 霉 素 发 酵 培 训 材 料一、 青霉素发酵工艺流程补料罐配制补料补料罐无菌料液米孢子制备消毒消毒通气搅拌移种 米孢子种子罐无菌培养基发酵罐无菌培养基成品发酵液通气搅拌培养发酵罐配制消毒种子罐配制接种种子二、工艺控制简介（一） 米孢子制备工艺流程砂土孢子单菌落斜面孢子茄子瓶孢子茄子瓶孢子计数小米培养基的调制分 离合瓶、封蜡罗氏米孢子瓶砂土孢子单菌落斜面孢子茄子瓶孢子茄子瓶孢子计数小米培养基的调制分 离合瓶、封蜡罗氏米孢子瓶1、菌种保藏的原理：是根据菌种的生理、生化特点，创造条件使菌的代谢活动处于不活波状态。保藏时先挑选优良菌种，最好选取它们的休眠体，然后创造一个最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等），以降低菌种代谢活动的速度，达到延长保存期的目的。2、菌种保藏的方法：1） 斜面低温保藏法：从砂土管、安瓿管或其他藏物内取出少量菌种或制成悬浮液接入新鲜的斜面上，在一定温度下培养，生长成熟后，放置2-4冰箱内保存，保存期:1-3个月.2） 石蜡油封藏法：此方法适用于不能用石蜡油做碳源的菌种，且方法简单易行。在无菌条件下将灭菌后的石蜡油倒入成熟的菌种斜面上，用量至少高出斜面1厘米，使菌种与空气隔绝，然后直立保存在冰箱或低温干燥处，保存期：一年左右。3） 砂土管保藏法：是保存抗生素产生菌常用的方法。优点是效果好，操作简便，保存期可达一年以上。砂土管孢子制备分为砂土制备和接种抽干两步进行。将砂和土按比例混合均匀，分装于12*100毫升小试管内，灭菌后烘干，并作无菌试验后备用。将要培养保藏的菌种斜面孢子刮下，直接与砂土混合，或用无菌水洗下孢子，制成悬浮液接入砂土管内混合均匀，混合后放在盛有无氧化二磷或无水氯化钙的干燥器中抽干（一般抽4-6小时）。然后置于放有干燥剂的干燥器或广口瓶内，盖紧密封，于2-4冰箱或冰库内冷藏备用。 青霉素菌种的保存使用砂土管保存，每年4月份、9月份制备两次用于菌种的筛选和复壮。4） 冷冻干燥法：是目前常用的较理想的一种方法。此种方法菌种可以保存1-5年，最多可达15年之久，但制备工艺较复杂，且需备有真空干燥和冷藏的设备，另外还需要保护剂，费用较贵。5） 大（小）米之保藏法：将要保存的菌种制成孢子悬浮液，取适量加入已灭菌的大（小）米培养基中，敲散搅匀，铺成斜面状，在一定温度下培养，待孢子成熟后取出置冰箱保存，或抽真空至水份在10%以下，低温或室温保存。我车间青霉素生产使用此方法，利用小米培养基接种孢子，成熟后置于2-4冰库保存，使用期限为20天；通常每年春节前制作一批干米作为备用米孢子。6） 低温冻结保藏法（低温保藏法）：将需要保藏的菌种（孢子或菌体）悬浮于10%的甘油或10%的二甲亚矾保护剂中，置于低温（一般为-20-70）冻结。保存温度视菌种不同而异，其优点是存活力高，变异率低，使用方便。7） 液氮冰箱超低温保藏法（液氮保藏法）：其优点是存活率高，稳定性强，是长期保存菌种的好方法，但要具备液氮和超低温冷冻条件，因此也不易推广。3、影响米孢子质量的因素：1）原材料质量；2）培养基温度和湿度；3）孢子龄和冷藏时间；4）孢子量；5）保藏方法的影响4、菌种选育的目的：1）提高发酵单位和发酵指数；2）改进产品质量；3）去除多余的代谢产物、合成新抗生素；4）降低生产成本（二） 发酵工艺1、培养基：（1） 定义：是供抗生素产生菌生长、繁殖、代谢和合成抗生素用的，按一定比例组成的营养物质和原料。（基础料培养基组成具有一定的局限性，要使发酵通过延长抗生素分泌期大幅度来提高发酵单位，还需要在发酵过程中进行代谢控制和中间补料，因此培养基的完整定义还需包括发酵代谢控制和有关的工艺控制措施。）（2） 培养基的成分及其功用：成分包括碳源、氮源、无机盐类、微量元素、前体（包括生长素和促进剂）等几大类。培养基的成分和配比产生的影响：A对产生菌的生长发育、产抗高低有影响；B影响提炼工艺和产品质量。A碳源：是构成菌体细胞和抗生素碳架及供给菌种生命活动所需能量的营养物质，它是抗生素发酵的主要原料之一。功用：a是能量的主要来源；b合成菌体细胞中各种有机物；c合成某些抗生素的碳架；d代谢的中间体是某些物质合成的前体物质。不同菌种的酶系统不同，所利用的碳源也不同：有的用淀粉作碳源适宜，有的利用葡萄糖或乳糖作碳源较适宜。青霉素发酵利用葡萄糖作碳源，头孢发酵利用豆油作碳源。青霉素发酵过程需要加入豆油起到消沫作用，因为青霉菌对豆油利用较慢，通常在糖类贫乏或接近用完时大量代谢，而且分解所放出的能量比糖多，需要供给充足的溶氧，如果溶解氧缺乏，容易造成脂肪酸的大量堆积，发酵罐表现为溶氧指标低，氨水加量大，影响菌丝的正常代谢，严重时导致菌丝自溶，发酵罐产量降低。故发酵后期尽可能增大体积的情况下，尽量减少加油量。B、氮源：是构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸、酶类等）和含氮抗生素等其它代谢产物的营养物质。常用的氮源分为有机氮源和无机氮源两类。有机氮源大多是天然有机物，除含有丰富的蛋白质、蛋白胨、多肽和游离氨基酸外，还含有少量糖类、脂肪、无机盐和生长素，是微生物的良好营养物质。因其原料产地、加工方法等不同，营养成分的含量也有较大差别，对发酵单位有较大影响。常用的有黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母粉等。无机氮源有硫酸铵、氨水等。使用有机氮源的目的：一是供给菌体生长繁殖所需要的营养物质；二是作为某些抗生素生物合成的前体或氮素来源。 青霉素生产所用的有机氮源为玉米浆，无机氮源为硫酸铵和氨水。玉米浆是用亚硫酸浸泡玉米的水经过浓缩加工制成的，是黄褐色的浓稠不透明的絮状悬浮物。玉米浆中含有较丰富的可溶性蛋白，很容易被菌体吸收利用，为抗生素发酵的良好氮源，它还有苯乙酸和苯丙氨酸，这些组分有青霉素G前体的作用。在合成培养基中加入玉米浆能刺激青霉素的形成和增加青霉素G的含量。玉米浆成分复杂，我公司玉米浆收料控制指标较少（还原糖、总氮、干物质及PH），对玉米浆的使用不能很好的控制，容易造成生产波动。如我车间使用的两个厂家的玉米浆，不同批次使用时，有时发酵代谢差异较大。目前根据外观（稀稠度、颜色等）、氨基氮、溶磷指标检测结果差别较大；另外种子组做摇瓶效价，由于不补料，可单独反映出玉米浆质量的好坏：两个厂家的玉米浆摇瓶效价差别为2000u/ml。C、无机盐和微量元素：抗生素产生菌在生长、繁殖和生物合成抗生素过程中需要某些无机盐和微量元素，如磷、钙、镁、硫、铁、氯等。生产中常用的无机盐类有：磷酸二氢钾、硫酸铵、碳酸钙等。主要功能：a构成菌体原生质的成分（如磷、硫等）；b作为酶的组成成分或维持酶的活性（如磷、镁、铁、钙等）；c调节细胞的渗透压（如食盐、氯化钾等）和PH值等；d参加抗生素的生物合成（如磷、硫、氯等）。具体功能如下：磷酸盐是核酸、核蛋白等重要细胞物质的组成部分，又是许多辅酶（或辅基）、高能磷酸键的组成部分。磷在菌体生长、繁殖和代谢活动中起着及其重要的作用。硫元素是菌体蛋白质的组成部分，它是参与合成含硫氨基酸的元素，也是某些抗生素分子中的组成元素（硫元素占青霉素分子量的9%，占头孢菌素C分子量的15%）。铁是过氧化酶类、细胞色素、细胞色素氧化酶等的组成部分，缺铁时这些酶类的合成和活力将受到影响。但培养基中铁离子浓度过高，就会抑制抗生素的合成，使发酵单位降低。镁、锌、钴等离子是某些酶的辅基或激活剂。钙是微生物代谢活动中酶的激活剂，发酵培养基中加碳酸钙来调节发酵过程的PH，与代谢过程中产生的酸起反应防止培养基变酸。钠离子能维持细胞的渗透压。钾离子与细胞透性有关，又是酶的激活剂，它与磷的传递有关。D、抗生素合成的前体与促进剂：抗生素合成的前体：在抗生素生物合成中，菌体用来构成抗生素分子而本身又没有显著改变的物质。如苯乙酸或苯乙酰胺是青霉素G发酵时的前体。一些前体是菌体本身能够合成的，如青霉素分子所需的缬氨酸和半胱氨酸。一些前体是需从外界加入的，在青霉素发酵培养基中加入苯乙酸或苯乙酰胺.。但前体浓度过大，则利用率越低，大多数前体对菌体有毒，故一次加入量不宜过多。青霉素采用补加的方式为青霉菌提供苯乙酸，通过检测发酵液中的苯乙酸残量，控制苯乙酸加量使苯乙酸残量的一定范围内。发酵液中苯乙酸残量过高对菌丝产生毒性，造成菌丝自溶，出现掉单位现象，使青霉素产量降低。加量过少，菌丝初级代谢旺盛，但单位生长慢，影响抗生素合成，同样使发酵产量降低。抗生素合成的促进剂：在发酵培养基中，加入某些微量的化学物质，可促进抗生素的生物合成，这些物质称为抗生素合成的促进剂（或称刺激剂）。（3）培养基的种类：A、按配方成分，培养基可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。抗生素生产用的是半合成培养基。B、按培养基形态分固体培养基和液体培养基。C、按用途分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。孢子培养基：是供菌种繁殖孢子用的，培养基要求能够使菌种发芽生长快，产生大量优质孢子，并且不会引起菌种变异。孢子培养基的组成因菌种不同而异。种子培养基：主要是指摇瓶种子及种子罐的营养成分。它是供孢子发芽、生长和繁殖菌丝用的。这种培养基的要求是其成分必须是一些容易被菌种直接吸收利用的碳源、氮源、无机盐和生长素等。培养基的组成也因菌种不同而异。一般种子培养过程不进行补料，培养基要求适当地丰富和完全，氮源和维生素的含量较高，但总浓度以略稀薄为宜。发酵培养基：是供菌丝迅速生长繁殖和合成抗生素用的。对这种培养基的要求是：营养要适当的丰富和完全。浓度适当，有利于菌丝的迅速生长繁殖，并进而大量合成抗生素。发酵培养基的组成不当或补料控制不当，影响菌体的正常代谢：a营养过于丰富，有可能使菌体初级代谢过于旺盛，大量繁殖菌丝，一方面溶氧值过低不利于菌体生长，另一方面影响菌丝向次级代谢转化，使抗生素合成受到抑制；b培养基营养缺乏，导致菌丝过早衰老自溶，缩短抗生素分泌期，造成发酵产量降低；c如果培养基营养不当，使菌体代谢途径发生偏移，造成异常代谢，影响单位生长等。发酵过程中进行的各种营养物质的添加和中间补料，可在一定程度上用以弥补发酵培养基的不足。一般补料有碳源、氮源和前体物质。（4）影响培养基质量的因素：A、原材料质量的影响：受来源、产地、品种、加工方法的不同使原材料质量有较大差异，用于生产，引起发酵水平的波动。B、灭菌的影响：由于使用蒸汽杀灭培养基中的杂菌，蒸汽温度过高或受热时间过长，培养基营养成分受到破坏而减少，某些营养成分之间可能发生反应，使原有成分减少而影响菌的代谢，或者产生一些对菌代谢有毒的物质（例如：糖类高温灭菌时容易被破坏，易和有机氮源结合，加热发生美拉德反应，生成褐色物质，产生氨基糖，从而使培养基颜色变深。对微生物产生一定毒性，严重时抑制微生物生长发育，破坏整个发酵过程；另外，无机盐也含相互作用，如钙盐和磷酸盐产生磷酸钙沉淀，减少营养成分）。青霉素发酵中液糖采用连消的方式保证消后质量，连消和实消的颜色差别较大，通过检测其透光率判断质量高低。另一方面通过控制消毒的温度和时间降低其影响。C、其它因素的影响：水质的变化、培养基的粘度等对发酵均产生不同程度的影响。2. 灭菌：（1）定义：所谓灭菌是指用物理或化学的方法或除去物料及设备中所有的有生命物质的技术或工艺过程。（2）工业生产中常用的灭菌方法：物理灭菌和化学灭菌。A化学灭菌：主要是使用化学试剂（如甲醛、洁而灭、75%酒精等） 进行某些容器或物料以及无菌区域的灭菌。B物理灭菌：优点是效果好，使用方便。主要方法有射线灭菌、热灭菌（分为湿热灭菌和干热灭菌）、过滤除菌；射线灭菌：通常用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌。热灭菌：分为干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌培养基的灭菌：1)培养基的灭菌分为实消灭菌、连消灭菌实消灭菌：即将饱和蒸汽直接通入装有配制好的培养基的发酵设备进行灭菌的一种方法。 我车间种子罐、发酵罐及部分补料罐（NS、PAA、油、水等）均采用实消灭菌。连续灭菌（连消）：即将培养基在发酵罐外，通过专用消毒装置，连续不断加热，维持保温和冷却，然后进入发酵罐的灭菌方法。我车间的液糖采用连消灭菌。连消灭菌是采用“高温快速灭菌法”。是通过连消塔和维持罐实现高温快速杀菌的目的，虽然高温快速灭菌所得的培养基质量较好，但培养基灭菌方法的选择，还须从工艺、设备、操作、成本及培养基的性质等具体条件来考虑决定。如我公司针对蒸汽价格持续上涨的情况，采取优化实消消毒工艺的措施达到减少蒸汽用量降低能源成本的目的。2)无菌检查及染菌的确定：通过霉菌室无菌人员定时镜检发酵液和取无菌样进行培养检查是否污染杂菌。确定染菌的依据：（1）镜检发酵液发现杂菌，如活酵母，野霉菌（不同于生产菌种），或个体较大的细菌（一般较难发现，可通过发酵滤液镜检，量大时才能确定）（2）连续三组出样且菌型一致时确定为染菌。3、发酵过程的控制：A种子罐：1)接种：种子罐培养基灭菌降温后，通过火焰接种接入米孢子。2)种子罐没有中间补料，通过控制一定的温度、罐压、空气流量培养。3)一般生产中种子移种条件：菌浓达到最大，PH出现回升，镜检菌丝脂肪颗粒减少，出现少量中小空泡。B发酵罐控制：温度：因为微生物的一切代谢活动都与酶系统的活力有密切关系，生化反应的酶活力都要在最适温度范围内发挥作用。温度过低，生长代谢慢，温度过高，酶活力降低，温度愈高，失活愈快，菌丝会提前自溶，合成抗生素时间缩短，降低抗生素产量。最适温度的确定：a菌种特性、b培养基配比、c培养条件、d与生长阶段有关。PH： PH同温度一样是影响酶活性的重要环境条件。最适PH值的确定：a菌种特性、b发酵温度、c发酵不同阶段。导致PH降低的因素：碳源（液糖、豆油）、生理酸性物质（硫酸铵等）、酸；导致PH升高的因素：生理碱性物质（氨水、硝酸钠、氨基酸、尿素等）、碱；发酵过程PH的调节：（1）根据菌种特性和培养基性质，选择适当培养基成分和配比。（2）加入适量的缓冲剂，控制培养基PH的变化。如基础料中加入碳酸钙可以中和各种酸类物质（有机酸或无机酸）防止PH急剧下降。（3）发酵过程中出现PH过高或过低情况时，可直接加入酸或碱类物质调节。（4）发酵过程通过设定合适的PH值，实现自动调整氨水加量控制PH值。发酵生产中，PH值的变化反映菌体的代谢情况，氨水加量是间接反映菌体代谢的重要参数。当发酵过程出现（1）氨水加量偏少（PH偏高）、氨氮偏低的情况时，通过增大硫铵加量调节PH及氨水加量；（2）氨水加量偏少（PH偏高）、氨氮偏高的情况时，通过增大液糖（或油）加量调整PH及氨水加量（3）氨水加量偏多（PH偏低）、硫铵加量大的情况时，通过减少硫铵加量调整；（4）氨水加量偏多（PH偏低）、硫铵加量正常的情况时，通过减少液糖加量调整。（5）氨水加量偏多有时是发酵代谢异常的一种表现，伴随氨水加量偏多出现加油量多，菌丝自溶，出晶体的现象，此时通过调整硫铵及液糖加量不能达到预期目的。需要综合各种影响因素确定并进行调整。溶氧：抗生素产生菌一般都是好气微生物，必须在有氧条件下培养，获得大量能量满足菌体生长、繁殖及分泌抗生素等需要。产生菌的生长代谢越旺盛，对氧的需要量就越大。影响发酵过程中需氧的因素：a生产菌种b培养基成分c菌丝浓度(菌丝量)d种子质量e泡沫及消沫剂加量f其它因素：有害物质的形成和积累，如二氧化碳等代谢产物的积累，对微生物有害，影响菌体