枯草芽孢杆菌细胞壁的研究进展.doc

韩超杨帆( 南昌理工学院生物环境工程系，江西 南昌 330008)摘 要:本文综述了近几年的枯草芽孢杆菌细胞壁的研究进展情况，分别从方法和结构两方面详细地总结了细胞壁的研究进展程度和应用价值，为以后的实验研究提供了理 论基础。关键词:枯草芽孢杆菌 细胞壁 研究枯草芽孢杆菌细胞壁的研究方法进展近年来，许多学者对细胞壁提取技术的研究取得 了显著进展。杨翠竹1等在酵母细胞破壁技术研究与 应用进展中提到微生物细胞壁的结构和强度取决于细 胞壁的组成以及它们之间相互交连的程度，破碎细胞 的主要阻力来自于连接细胞壁网状结构的共价键。了 解细胞壁的组成和结构，有助于选择合适的破壁方法。 顾红梅等2研究了超声波辅助提取花色甙的最佳 条件，并首次将超声波技术与冻结 融解技术相结合 用于花色甙的提取。实验表明，超声波辅助提取法优 于常规提取方法，而冻结 融解 超声波提取法表现出更好的提取效率。杨琳，夏天瑶等3将短棒状杆菌 7721 株用冷热外 压法获得细胞壁，再经苯酚及三氯甲烷萃取肽聚糖成 分。提纯品经紫外吸收测定、淋巴细胞转化试验、抑瘤 试验、脾激活试验、毒性试验证实，具有生物学活性及 安全性。其主要成分经生化检测含有多肽及聚糖类物 质。短棒状杆菌的有效成分是细胞壁上的肽聚糖类物 质，实验采用的提纯工艺具有可操作性和实际应用价 值，为新产品开发提供了可靠依据。单振秀等4对影响富硒酵母自溶条件: NaCl 浓度、 pH 值、温 度、时 间 进 行 了 研 究，结 果 表 明: 3% NaCl， pH5 5，55 ，20h 的条件下，自溶物中氨基酸含量最高， 为最佳自溶条件; 对影响酸热破碎法的条件: 酸浓 度、热 处 理 时 间、浸泡时间进行了研 究，结 果 表 明:3mol / LHCl，浸泡 60min，热处理 3min，迅速冷却的条件 下，氨基酸含量最高，为最佳破碎条件。将两种方法进 行比较，发现破碎后内容物溢出量及硒含量非常接近， 差别不明显。孙海翔等5采用高压均质机破碎啤酒酵母细胞壁 提取细胞质中 RNA，酵母浓度、工作压力及循环次数对 细胞破壁率有影响，当酵母干物质浓度为 15% ，压力为70MPa，循环 3 次，酵母细胞破壁率达到 70 99% 。李兰，张明霞等6人通过对枯草芽孢杆菌、蜡样芽 孢杆菌、枯草转酮醇酶变异株、地衣芽孢杆菌进行试验，比较四种不同破壁方法对细菌产 SOD 活性影响的研究，得到一种最有效的细菌破壁方法，应用于从细菌 中提取 SOD 的破壁处理。实验结果表明: 四种破壁处 理间均达到显著差异 水 平，并且助融剂破壁处理后 SOD 活性明显高于其他三种处理方法，即助融剂破壁 效果最好，是最适合细菌提取 SOD 的破壁处理方法。W Park and MMatsuhashi7在 Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus peptidoglycan transglycosylases1that are not penicillin binding proteins 一文中提到了，肽聚糖的转糖基酶的活性并不是青霉素蛋白质的活性，而是革兰氏阳性菌( 不是大肠杆菌) 中肽聚糖的交 联网状结构被类似于青霉素两端的蛋白质( 转肽酶和 转糖基酶) 的活性起作用而合成，同时革兰氏阳性菌的 细胞壁的肽聚糖层通过转肽酶合成，能被转糖基酶分 解。龙小海8在链球菌细胞壁和核物质的透射电镜观 察中提出，磷钨酸悬滴法负染色的链球菌用透射电镜 观察，可形象直观地看到细菌的细胞壁和呈环带状的 核物质。枯草芽孢杆菌细胞壁结构研究进展枯草芽孢杆菌是一类需氧的有柱状内芽孢的 G + 菌，菌体为直杆状，0 5 2 5 1 2 10m，具有周生鞭 毛。在环境条件恶劣、营养缺乏的情况下，枯草杆菌会 停止生长，在菌体内形成一个对热、紫外线、电离辐射 和某些化学药品有强抗性的芽孢9。芽孢壁主要由肽 聚糖( PG) 组成，它是由若干 PG 单体所组成的网目状 大分子，而 PG 单体又是由 N 乙酰胞壁酸( M) 和四肽 链组成。G 和 M 交替排列，通过 1，4 糖苷键连接成 聚糖链骨架，四肽链则是通过一个酰键与 M 相连10( 见图 1) 。革兰氏阳性细菌的细胞壁是由含膜磷壁酸和壁磷2壁酸的肽聚糖( peptidoglycan) ，其厚度约为 20 80nm，由 40 层左右的网状分子组成和周质空间构成; 而革兰氏阴性细菌的细胞胞壁则较为复杂，除 有 一 层 很 薄( 2nm) 的肽聚糖结构外，在其外还有一层( 20 100nm)类酯多糖( lipopolysaccharides，LPSs) 包被，其内层是类酯膜。被转运到细胞膜外。第 3 阶段主要发生在细胞膜外的周质空间，由不同种类的青霉素结合蛋 白 ( penicillin binding protein，PBP) 通过转糖基( transglycosylation) 和 转肽作用( transpeptidation) 完成肽聚糖的组装以形成 细胞壁。实验证明，细胞壁具有一定的机械强度和柔韧性， 对细胞起保护作用。细胞内含有大量的有机物和无机 盐，可导致细胞内产生很大的渗透压。这种渗透压又 可产生一种作用于细胞膜的力，细胞壁则起着可以承 受这种力的作用。细胞壁的另一主要作用是赋予细胞 一定的形态学特征。例如: 用酶解或其它方法在一定 条件下处理细胞除去细胞壁，再把这种无壁细胞放在 等渗溶液中，细胞则成球形，再不会成为原来的细胞形 态。此外，细胞壁是一种由大分子组成的“网格”结构， 可以起到分子筛的作用; 细胞壁的化学组成使细菌具 有一定的抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性。近年来，在细胞壁结构方面，许多学者做出了重要 研究。像 Jung Suk Jang 等17在肽聚糖单体结构的质 谱分析中提出，抗生素是对细胞膜外的细胞壁中的肽 聚糖合成最有效的干扰，然而许多抗生素不再对耐甲 氧型细菌有效，这种改变和肽聚糖结构的变化有关，即 使它们的功能关系现在不是很明确。Jennifer Meador Parton 等18 在枯草芽孢杆菌芽 孢的形成过程中肽聚糖的结构研究一文中提到，芽孢 的肽聚糖层由内外两层组成，内层是生殖细胞壁，和植 物细胞壁类似，在芽孢的萌芽时期是原始细胞壁层; 外 层是皮质层，是改良后的结构，在维持芽孢脱水方面是 必需的，同时在芽孢的萌芽时期逐渐衰退。从而得出 这样的结论: 孢子的肽聚糖与交联的广泛范围内得以 保持，并可能参与孢子核心的脱水。数据表明，一定程 度的孢子肽聚糖交联结构可能更直接的影响孢子的萌 发和生长。蒋凌月，李铭刚等19 在细胞壁氨基酸的定量分析 在放线菌分类中的应用研究中提出用薄层色谱扫描法 与氨基酸全自动分析仪分析法相结合，分别定量分析 了 70 株典型菌株胞壁的 DAP 和其他种类氨基酸，把它 们按四大类型来进行分析，根据这些定量结果，建议对 原来的胞壁类型定性划分标准作必要修正。葛小鹏，潘建华等20 对蜡状芽孢杆菌在重金属生 物吸附条件下细胞的界面形态及其变化情况进行了原 子力显微镜成像观察与表征 结果表明，在严格实验对 照条件下未加入 Pb( II) 的空白菌体细胞呈杆状，单个 细胞长约 33m，横截面分析结果为宽 19m 左右，高为03 04m，细胞壁表面比较光滑，细胞之间以竹节结构 首尾相连排列成长杆状; 吸附 Pb( II) 后细胞的体积则 发生膨胀，单个细胞长约 39m，横截面分析结果为宽31m 左右，高约为 115m，细胞壁表面变得比较粗糙，图 1 肽聚糖的立体结构图 2 单体分子构造细胞壁的主要成分是肽聚糖( peptidoglycan) ，又称 胞壁质( murein) ，由肽和聚糖两部分组成，肽有四肽尾 和肽桥 2 种，聚糖则由 N 乙酰葡糖胺和 N 乙酰胞壁 酸相互间隔连接而成11。众多肽聚糖分子以糖苷键和 肽键交织成网格状覆盖在整个细胞上。由于胞内渗透 压对细胞壁的挤压，导致每个肽聚糖结构单位在相邻 单位的拉伸下近似六边形12。肽聚糖在细菌中的生物合成根据功能区域大体分 为 3 个阶段13。第 1 阶段发生在细胞质中，首先 UDP GlcNAc 在 MurA 催化下与 PEP 反应生 UDP GlcNAc enolpyruvate，接着在 MurB 催化下与 FAD 和 NADPH 反应 生 成 UDP MurNAc，随后通过一系列 连 接 酶 ( MurC F) 的作用将 L Ala、D Glu、m DAP( 革兰阴 性菌) 或 L lys ( 革兰阳性菌) 和 D Ala D Ala 在ATP 参与下依次连接形成 UDP MurNAc penatapep- tide14。除直接参与这个通路的酶以外，有些为该通路 提供底物的酶类，尤其是细菌特有并在不同种属中保 守性较高的，也可作为抗菌药物靶标如 D Ala 支路中 的丙氨酸 消 旋 酶 ( Alr ) 和 D Ala D Ala 连 接 酶( Ddl) 15。第 2 阶段主要发生在细胞膜内侧附近，通 过 MraY 和 MurG( 也有报道认为 MurG 存在于胞膜外 侧16) 对前面形成的五肽进一步固定 ( 先 与 跨 膜 的 C552P 结合形成 Lipid ) 和加工( 再与 UDP GlcNAc 结合形成 Lipid) ，然后 Lipid通过尚不清楚的机制菌菌株 Bif1101，用 TritonX 100 处理 BL 肉汤培养物，高速离心分离不可溶沉渣，经蛋白酶 E、胃蛋白酶、 糜蛋 白 酶、胰 酶、核 酸 酶 消 化，甲 醇 与 氯 仿 除 脂，001NH2 SO4 处 理 等 步 骤 提纯而得到精制完整肽聚糖 ( whole peptidoglycan，WPG) 。化学组分分析结果显示 WPG 主要由多肽与糖组成，其氨基酸组成与菌体基本 相同。扫描电镜观察发现提取的 WPG 保留其原菌体 细胞完整结构。王静华，赵洪涛等22 在细菌细胞壁肽聚糖的研究 进展中综述了细菌细胞壁 PG 的结构与分类、分离纯 化、生物合成、代谢过程、生物学功能、免疫作用机制及 应用前景。David L Popham 等23在 Analysis of the Peptidogly- can Structure of Bacillus Subtilis Endospores 中提到由革 兰氏阳性菌属产生的芽孢是处于休眠状态的细胞，它 可抵抗快速致死营养细胞的物理化学处理。这些抗性 源于细胞结构和内容物的各种诱变，芽孢耐热性的决 定性因素是芽孢原生质体的相对脱水程度，而芽孢相 对脱水程度是由周围肽聚糖结构来维系的24 27。这 一结构有芽孢壁和芽孢皮层组成，芽孢壁结构和营养 细胞肽聚糖结构相似，并且芽孢壁可充当孢子萌发时 营养细胞的前体28。芽孢皮层肽聚糖有一个特异结 构，即大约 50% 的胞壁酸残基侧链缺失，这些残基最终 转化为胞壁内酰胺和 L 丙氨酸29、30。为了进一步阐 明芽孢皮层在实现和维持失水或吸水方面的作用以及 这些作用的重要性，研究者找到了一种定性分析肽聚 糖结构的方法，即通过高效液相层析法 氨基酸 氨 基糖的分析以及基质辅助激光解吸与电离飞行时间质 谱仪的使用来检测野生型或突变型菌株芽孢肽聚糖结 构的分析。在生物组织内部存在大量的生化、生理反应以及 分子的扩散运动，它们相互独立，又相互关联，共同构 成一个生化反应网络在病理条件下，某些生化反应过 程会发生改变，代谢中间体可能会出现质和量的变化。 核磁共振( NMR) 可以对这些过程的研究提供非常有用 的信息。目前，有 3 种核磁共振波谱技术可以用于生 物组织的研究: 活体组织定域波谱技术; 生物组织 提取物的液体高分辨核磁共振技术; 离体组织的高 分辨魔角旋转技术。这些方法各有优劣，互为补充。 介绍了在生物组织的研究方面的最新进展31。高秀香，徐怡庄等32 在介绍肿瘤样品代谢物的核 磁共振波谱技术的研究方法的基础上，从离体组织和 活体组织两个方面综述核磁共振波谱( NMR) 在诊断肿构和组成信息，因此它在癌症的早期诊断中具有很好的前景。在活体核磁共振波谱诊断肿瘤方面，主要应用1 H31和 P 核磁共振波谱，结合 MRI 为非侵入性肿瘤分析提供了一种临床可用的方法。MRI 与 MRS 技术的结合将 使核磁共振波谱在医学领域有更大的应用空间。高分辨魔角旋转核磁共振波谱 ( high resolutionmagic angle spinning magnetic resonance spect roscopy，HR MAS NMR) 是 20 世纪 90 年代新发展起来的一种核磁共振技术，它能够快速有效地检测组织代谢物的 分子结构和组成33。高分辨魔角旋转核磁共振技术是借用固体核磁共 振中的魔角旋转技术，让生物组织绕与静磁场成( 547) 角的方向快速旋转( 2 0 5 0kHz) ，从而有效地平 均掉由于生物组织内各种相互作用和磁化率不均匀引 起的谱线增宽，提高了图谱的分辨率。HR MAS NMR 技术的优点很多: 对组织的破坏性小，一次性检测到的 代谢物种类多，需要的样品量少，高通量的结构 / 动力 学信息等等。这些优点使得 HR MAS NMR 技术广泛 应用于生理和病理状态下生物组织的代谢表征的研 究，为疾病的诊断和治疗提供了有用的生化信息，由于 所需要的样品量少( 10 20mg) ，HR MAS NMR 技术 对于分化不均一的组织( 脑、肾脏等) 中各亚区的代谢 物研究有着其独特的优势34。参考文献1杨翠竹，李艳，阮南等 酵母细胞破壁技术研究与应 用进展J 食品科技 2006，7: 138 1422顾红梅，张新申，蒋小萍 超声波法和冻结 融解法 相结合提取紫薯中花色甙J 食品科学 2004，25 ( 7) : 104 1083杨琳，夏天瑶，白春杰等 短棒状杆菌胞壁肽聚糖的 实验研究J 中国微生态学杂志 2006，18 ( 5) : 360 3624单振秀，江澜，王宜林 富硒酵母细胞壁破碎方法的 比较 细胞自溶法和酸 热破碎法J 西南农业 大学学报 2001，23( 4) : 365 3735孙海翔，尹卓容，马美范 高压均质破碎啤酒酵母细 胞壁的研究J 食品工业科技，2002，23 ( 2 ) : 66 676李兰，张明霞，袁金辉 不同破壁方法对细菌产 SOD活性的影响J 食品工业科技 2008，29 ( 10 ) : 108 1117W Park and M Matsuhashi Staphylococcus aureus andMicrococcus luteus peptidoglycan transglycosylases that are not penicillin binding proteins J Bacteriol 1984February，157( 2) : 538 5448龙小海 链球菌细胞壁和核物质的透射电镜观察微生物学杂志 2002，22( 1) : 619栗建林，张丽帼，刘建中等 轻稀土对小鼠肺腺癌的 抑制作用J 中国稀土学报 1998，16 ( 2 ) : 183 18610邓汝温，张仲生 稀土药物和药学性质J 稀土1987，3: 36 4711周德庆 微生物细胞的结构和功能 见: 沈萍主编 微生物学 北京: 高等教育出版社 2000，38 7412Koch AL1 Bacterial wall as target for attack: past，present，and future research1 Clin Microbiol Rev，2003，16: 673 68713Silver LL1 Does the cell wall of bacteria remain a via- ble source of targets for novel antibiotics Biochem Phar- macol 2006，71: 996 100514Green DW The bacterial cell wall as a source of anti- bacterial targets Expert Opin Ther Tar 2002，6: 1 1915Walsh CT Enzymes in the D alanine branch of bac- terial cell wall peptidoglycan assembly J Biol Chem1989，264: 2393 239616Projan SJ New( and not so new) antibacterial targets from where and when will the novel drugs come CurrOpin Pharmacol 2002，2: 513 52217Jung Sug Jang，Jin Sung Kim，Young Hwan，andYoon Seok Chang Structure Elucidation of Methicillin Resistant Peptidoglycan Monomer by Tandem MassSpectrometry Bull Korean Chem Soc 1995，16: 9 1122王静华，赵洪涛，汪以真 细菌细胞壁肽聚糖的研究进展中国兽药杂志 2004，38( 1) : 38 4023David L Popham，Jari Helin，Catherine E Costello， and Peter Setlow Analysis of the Peptidoglycan Struc- ture of Bacillus subtilis Endospores Journal of Bacteri- ology 1996，178( 22) : 6451 645824Beaman，T C ，and P Gerhardt Heat resistance of bacterial spores correlated with protoplast dehydration， mineralization，and thermal adaptation Appl Environ Microbiol 1986，52: 1242 124625Nakashio，S ，and P Gerhardt Protoplast dehydra- tion correlated with heat resistance of bacterial spores J Bacteriol 1985，162: 571 57826Popham，D L ，B Illades Aguiar，and P Setlow The Bacillus subtilis dacB gene，encoding penicillin binding protein 5* ，is part of a three gene operon re- quired for proper spore cortex synthesis and spore core dehydration J Bacteriol 1995，177: 4721 472927Popham，D L ，S Sengupta，and P Setlow Heat，hy- drogen peroxide，and UV resistance of Bacillus subtilis spores with increased core water content and with or without major DNA binding proteins Appl Environ Microbiol 1995，61: 3633 363828Tipper，D J ，and P E Linnet Distribution of pepti- doglycan synthetase activities between sporangia and fo- respores in sporulating cells of Bacillus sphaericus J Bacteriol 1976，126: 213 22129Warth，A