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本科毕业设计论文题 目 专业名称 学生姓名 指导教师 毕业时间 摘要茶树(Camelliasinensis(L.)0.Kuntze)是我国重要的经济作物之一。茶叶富含多种次生代谢产物，其中多酚类物质具有多种重要的生理功能，在食品和医药等行业具有巨大的应用潜力。多酚氧化酶与茶叶加工密切相关，不同的茶叶类型需要不同的多酚氧化酶活性，如加工红茶的品种需要较高的酶活性，而生产绿茶则希望有低的酶活性。本项研究重点在茶树多酚氧化酶基因的克隆和茶树遗传转化系统方面，结果如下。根据已经发表的多酚氧化酶基因中的保守序列，设计兼并引物，利用nest一PCR技术，首次在茶树中克隆了多酚氧化酶基因。该基因已经在GenBank上登录，登录号为AF269192。序列分析表明，茶树多酚氧化酶基因与其他植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性，尤其在铜离子的结合部位，所有的植物基本上一致。进化树分析表明，茶树的多酚氧化酶可以与大多数的一个组。通过对茶树茎培养的激素水平和相互关系的研究，以叶片数为生长指标，初步明确了茶树茎培养所需的激素条件。统计结果表明，NAA和BAP的浓度对培养材料的影响很大。在培养的早期，不同浓度的NAA对茎生长作用效果不甚明显，未达到统计上的显著水平。但随着生长的进程，NAA的浓度效果逐渐显现，即不同浓度的NAA对生长的影响显著不同，在统计上达到极显著水平。与NAA的作用效果不同，不同的BAP浓度对茶树茎生长的作用一直有着极显著的效果差异。同时通过统计分析还首次发现了NAA和BAP对茎的生长没有互作作用。研究表明，茶树茎培养的较为适宜的生长调节剂浓度为BAP2.5一5mg/L、NAA0.5一1mg，lL，在这个浓度条件下，经过60天的培养，一个茎最多可生长到巧片叶片。我们以GUS的瞬间表达为指标，对根癌农杆菌介导的茶树转化系统关键词:NAA，茶树(Camelziassnensis(L.)0.Kuntze)，多酚氧化酶基因，BAP，转化系统ABSTRACTTeaPlant(Camelliasinensis(L.)0.Kuntze)，oneofmostimPortantecorlomicPlantinChina，eontainsabundantseeondarymetabolieProduets，whlehPolyPhenolsPossessimmensePotentialforfoodandmediealindustriesduetotheirvariousPhysiologiealfunetionsforhumanbody.ThePolyPhenoloxidases，asarewellknown，PlayvitalrolesinteaProeessinghighenzymatieaetivity15infavorofblaekteawhilelowenzymaticaetivitybenefitsgreentea.InPresentstudy，wefoeusonPolyPhenoloxidase(PPO)geneeloningandtransformationsystemofteaPlant.TheresultswererePortedasfollows.TheeffeetsofNAAandBAPatvariouseoneentrationssuPPlementedtoMSmediumonteastemeulturewereinvestigatedwiththenumberofnewlydeveloPedleavesasgrowthindex.ItshowedthattheeoneentrationsofNAAandBAPhadgreatinflueneesonthegrowthofeultures.NAAatdifferenteoneentrationsshowednoeonsiderablydifferenteffeetsonthegrowthofeulturesatearlyeulturestage，untilthestemswereeulturedfor50days.IntheeontrastBAPatvariouseoneenirationsexertedsignifieantdifferenteffeetsonthegrowthofeulturesfromthebeginningofculturing.FurtheorevasfirstlyProvedthattherewasnointeractionbetVeenBAPandNAAonthegrohofeultUredstembasedonbiostatisticanalysis.ThePresentstudyindieatedtheoPtimistieconeentrationforteastemeulturewasBAP2.55mg/LandNAA0.5underwhlchonestematitsheighteoulddeveloPabout15leavesaftereulturing60days.ThefaetorsaffeetingtheAgl闷Obacteriumtumefaciens一mediatedKeywords:Tea(Camellia51:ensis(L.)0.Kuntze)，PolyPhenoloxidase目录第一章绪论31.1茶树再生系统研究进展31.1.1胚培养31.1.2花药培养31.1.3芽培养41.1.4茎培养41.l.5叶培养41.2植物生长调节剂的影响41.2.1抗生素浓度的选择51.2.2农杆菌菌株对茶树遗传转化的影响51.2.3启动子的影响51.2.4光照的影响51.2.5乙酞丁香酮对茶树遗传转化的影响51.3茶树基因克隆研究进展6第二章茶树多酚氧化酶基因的克隆62.1材料和方法62.1.1材料62.1.2方法62.2结果和讨论62.2.1多酚氧化酶基因克隆62.2.2核营酸序列比较62.2.3氨基酸序列比较72.2.4植物多酚氧化酶的进化树分析7致谢8第一章绪论茶树(命切盯/勿万加日浴7s)是一种重要的经济作物，在我国的植历史已有三千余年。随着对外的交流，茶树的种植、加工和饮用也逐渐流传到其他国家，目前已成为世界上三大无酒精饮料之一。中国古代就有“诸药为各病之药，茶为万病之药”之说，近年来的研究和调查更证明茶叶对人有重要的生理保健作用，如防龋齿作用、抗菌抗病毒作用、抗氧化功能、降血压血脂胆固醇、抗癌抗突变效应等。不仅有越来越多的人饮茶，而且也利用茶叶提取有效成分和加工医药产品等。市场对茶树品种的要求也越来越高，传统的育种虽然育成了大量的优良品种，但难以满足人们日益增长的需求。因而，利用生物技术改良和育成新一代茶树品种已成为国内外茶学研究的热点问题之一。1.1茶树再生系统研究进展种子是植物组织中分化程度最低的部分，具有较强的再生能力，许多植物都以种子的部分组织建立了再生体系。在茶树中利用这部分组织进行培养的研究较多，而利用叶片、茎等营养器官进行培养的研究结果相对较少。营养器官的再生在植物组织培养中成功率较低，主要涉及到器官的脱分化和再分化等复杂的过程。由于这方面的机理尚不清楚，难以获得满意的培养结果。1.1.1胚培养颜慕勤等(1983)用茶树子叶离体培养得到了胚状体。并且认为胚状体起源于子叶表皮，在胚胎发生的最初分隔方式上与合子胚不同。茶树胚状体发育过程与合子胚一样，由于表皮的发生而进入球形胚原阶段，细胞在特殊的顺序下进一步分裂形成了胚状体主体和胚柄，使胚状体进入球形期;接着是子叶的伸出，上胚轴芽原基的形成;下胚轴芽原基的形成使胚状体进入心形期，由于下胚轴的伸长而进入鱼雷期，最后由于芽的生长和根的株。从茶树子叶柄分化形成的胚状体，在发育阶段上是不同步的。在同一外植体上可看到胚性细胞团和球形胚、心形胚、鱼雷形胚、肾形胚和香蕉形胚等(刘德华等，1989b)。在茶树子叶柄培养中，近轴端不定芽的分化率高，随着子叶柄断面离胚轴距离的增大，其分化率降低，而不定胚的分化率则相反。可能在茶树子叶柄中存在极性梯度，越靠近胚轴端单极性越强，越靠近子叶端双极性越强(刘德华等，1999b)。刘德华等(1999a)还发现在细胞分裂素/生长素比值低及添加GA3的培养基上，子叶柄、叶柄愈伤组织的畸形胚分化率较高。但大多数畸形胚在转化培养基上经过一定时间的培养，最后均能直接诱导成苗。刘德华等(1988)用茶树种籽的下胚轴为材料经过培养最后得到了芽的分化。不同茶树品种之间的诱导效果差异不大。BA对芽的诱导有较好的作用。1.1.2花药培养与其它的植物一样，茶树的花药培养非常困难。陈振光(1983)第一个报道了获得再生的茶树单倍体植株。不同的培养基对茶树花药培养的效果有较大的影响，主要是由于愈伤组织的形成与培养基类型有较大的关系，而花药培养获得的再生植株几乎都是在愈伤组织发生率很低的培养基上得到的，N6可能是茶树花药培养较为适宜的培养基。高浓度的2.4一D和低浓度的蔗糖均能促进药壁愈伤组织的发生，不利于花药培养。全光照对药壁愈伤组织的诱导有强烈的抑制作用。这些研究暗示单倍体细胞与二倍体细胞所需的培养条件有较大的差异。下门久(1995)通过花药培养获得了1000多株由体细胞途径再生的单倍体植株。不同茶树品种间的差异，即基因型对单倍体再生植株的成功率有很大的影响，在下门久总共获得的1175株再生花药植株中，就有1110株是来自于同一个1.1.3芽培养Agarwal等(1992)用茶树的顶芽和腋芽进行了无性繁殖研究。发现用1/2MS附加10%CM，2.9抖MIAA和17.8扒MBA是较为适宜的生芽培养基，而1/2MS附加n.4林M抗坏血酸和34.5林MIBA则是较为适宜的生根培养基。茶树腋芽培养的成功率与培养材料的采集时间有很大的关系。以春季的材料段，从而形成畸形胚。但其表皮细胞能重新脱分化，进而再生出胚状体。茶树叶诱导愈伤组织的效果与品种有一定的关系(刘德华等，1991)。多酚类含量高可能会影响到诱导的效果。在培养过程中，叶柄基部切口处形成的球状愈伤组织上有肉眼可见芽点，并能很快地诱导出芽和胚状体。用茶树叶的不同部位作为外植体，对培养的最终结果有很大的作用(Parketal.，1997)。愈伤组织和根一般从叶的基部和顶端发生，胚一般在叶缘处发生，而不定芽仅能从中脉形成。在廿十片愈伤组织形成过程中，叶片外植体上叶肉中的小叶脉周围以及主脉中的薄壁细胞首先启动，脱分化而进行分裂，形成分生细胞团，继而形成愈伤组织。在此过程中，细胞壁以及细胞器也发生了相应的变化(暨淑仪等，1995)。以幼叶为材料在不同的2.4一D水平的培养基中培养，在叶的基部能直接或经胚性愈伤组织诱导出体细胞胚，这种诱导效果与叶龄成反比。组织学观察表明体细胞胚起源于叶片中脉(Katoetal.，19%)。茶树叶柄具有较强的芽、胚状体、胚性细胞团分化能力(刘德华等，1989a)。经过培养，在叶柄和愈伤组织交界处，有一些微小突起能发育成芽，其成芽过程与子叶柄、下胚轴培养直接形成芽大致相似。而愈伤组织经过培养，在其皱起的表面形成胚状体。1.1.4茎培养Kim等(1998)用茶茎培养得到了植株。不同品种之间的差异不大，在BA1一5mg/L范围内，均能促进茎长和叶片数的增加，以及诱导愈伤组织。NAA能增加根的数目，但只有IBA(l一3mg/L)能促进根的发育。不同的器官诱导生根的能力有所不同(Kim1986)。叶片为29.45%，茎为50.巧%，而根为43.95%。有不少因素影响到茶树茎培养不定芽的分化率(青岛洋一，1998)。不同的激素要求浓度不同，IBA在0.01一0.5mg/L之间，BA在1一10mg/L之间较好，而添加了5mg/L的GA3的的处理其分化率反而有所下降。糖的种类也有较大的影响，通过比较蔗糖、葡萄糖、半乳糖等几种不同的糖，以蔗糖在3%的浓度时分化率最高。1.l.5叶培养王毅军等(1994)用叶片愈伤组织诱导形成了胚状体，并得到了完整的植株。在胚状体的发育过程中，每一发育步骤都可能受到某种阻碍而停滞在某一发育阶.1.2植物生长调节剂的影响不同的品种、不同的起始培养材料，其要求的激素种类、绝对量及其比值的差别很大。其中的规律尚不清楚，一般均需要通过试验摸索最佳的培养条件。子叶培养在单独使用2.4一D其用量在1.5mg/L以下时对胚状体的形成有促进作用，用量超过1.5mg/L时不形成胚状体。2.4一D与KT或BA配合使用时则能提高胚状体的分化率。但培养基中生长调节物质含量的多少与胚状体的分化率之间并无明显的规律。BA在茶树胚状体分化及假胚珠的继代繁殖上的效果是良好的，但在此培养基上只有极少数的胚状体成苗。在含zTZmg/L和NAA0.smg几的培养基上，不管是否脱离外植体及假珠芽，经过1个月的培养胚状体都能长成小植株(颜慕勤等，1983)。对于培养腋芽，添加了1mg/L赤霉素的培养基中腋芽生长较好。可能赤霉素起着很重要的作用(刘德华等，1991)。并且赤霉1.2.1抗生素浓度的选择在植物的转化研究中，由于许多常用的植物表达载体带有NPTll基因，因而卡那霉素(Kan)是一种常用的选择抗生素。Kan对茶树愈伤组织的发生有一定的抑制作用，一般超过50mg/L后，茶树很难再产生愈伤组织。因而实际中使用的浓度在50mg/L左右(骆颖颖等，2000;奚彪，1995)，但也有高达200mg/L(Matsumotoetal.，1998)。在很强的选择压条件下，可能会强烈抑制非转化组织发育，减少后期的筛选工作。在诱导芽分化时，较低的Kan即可起到抑制茶树芽分化。而在诱导根分化时，苗对Kan的抗性有了较大的提高(奚彪等，1997)。这种变化可能与培养材料的生理状况有关。1.2.2农杆菌菌株对茶树遗传转化的影响用于遗传转化的农杆菌一般分为根癌农杆菌和发根农杆菌，根癌农杆菌根据其诱导植物细胞产生的冠瘦碱种类不同分为三种类型，即章鱼碱型(cotoPinetyPe)、胭脂碱型(nopaline帅e)和农杆碱型(abropin帅e)。青岛洋一等(1998)用EHA101、LBA4404、PC2760、GV3101和MPg等5种农杆菌侵染茶树的子叶，结果发现EHA101的侵染效果最好，GUS的瞬间表达率最高达到60%，其次是PC276O和LBA4404，GUS瞬间表达分别为34%和28%，而GV3101较差，GUS瞬间表达为4%左右，MPg几乎没有效果。1.2.3启动子的影响启动子的强弱，直接决定了目标基因表达的强弱，及表达特点，因而表达载体的不同，所带的启动子也就不同，从而会影响到农杆菌侵染的效果。青岛洋一等(1998)用带有两种不同的启动子的载体进行试验，发现用E7一P35S一们置换P35S后，其GUS瞬间表达可增加10%左右。不同的农杆菌，其促进的效果有所差异。但对于Gv3101，P35S启动子优于E7一P35S一Q】。从实验中的结果可以发现启动子与农杆菌存在一定的相互关系。1.2.4光照的影响试验发现光对某些植物的遗传转化有抑制作用，所以一般转化在共培养阶段均是采用28暗培养。在茶树的转化中，培养条件也是采用28暗培养2一3天(Matsu-motoetal.，1998，骆颖颖等，2000)，均获得了较好的效果。但也有研究表明，在16小时光照的培养条件下，GUS瞬间表达比在完全暗培养条件下有较大的提高，其促进的幅度随试验材料的不同而有所不同，最高可达到70%左右(青岛洋一等，1998)。Konwar等(1998)用12小时的光照也得到了较好的效果。1.2.5乙酞丁香酮对茶树遗传转化的影响乙酞丁香酮在农杆菌介导的遗传转化中起重要的作用，它能使农杆菌向伤口处集中，促进侵染过程的发生。在根癌农杆菌侵染茶树的研究中(Matsumot。etal.，1998)，没有添加乙酞丁香酮的处理中，没有出现抗性愈伤组织。而乙酞丁香酮在10扒M时，有巧%的愈伤组织的生长指数为1。乙酞丁香酮浓度增加到100林M时，有35%的愈伤组织的生长指数为1，20%的愈伤组织的生长指数为2。而当乙酞丁香酮浓度增加到500林M时，愈伤组织中生长指数为l的有45%，生长指数为2的有10%，而生长指数为3的占25%。在我们实验室的发根农杆菌转化茶树的研究中(奚彪等，1997)，发现在100mg/L(约500林M)乙酞丁香酮的条件下，仍然必须有较强的侵染条件才能诱导毛根的发生。对于大多数植物，乙酞丁香酮的工作浓度在0.1一100林M，而茶树所需的浓度大大超过这个范围，可能与茶树具有较强的次生代谢有关，如与茶树中富含多酚类有关。1.3茶树基因克隆研究进展伴随着生物学，尤其是分子生物学的发展，在对茶树的研究过程中，越来越多的基因被克隆。这为进一步从分子生物学角度研究这些基因的功能、结构、调控等打下了基础，为进一步通过基因工程来调控其表达提供了前提。茶树主要特点之一是次生代谢较为复杂，有许多次生代谢产物如茶多酚、咖啡碱等对人体有着一定的生理作用。由于对这些方面比较重视，基础的研究较多，因而茶树中被克隆的基因多数是与次生代谢途径有关酶类目前茶树中已经克隆的基因在GenBank中登录的有九个，见表1.1。受态细胞制备与转化将新培养的OD6000.5左右的E.ColsDH5a在冰上放置30min，然后4oC30009离心10min。用预冷的100mMeaC12轻轻悬浮沉淀，冰上放置30min，4oC30009离心10min。用适量的含15%甘油的一00mMCaCI:轻轻悬浮沉淀，冰上放置分钟，分装成200川，立即使用或贮存于一70保存。取5贝连接产物加入到感受态细胞中，冰上放置30min，在42水浴中热激90see后迅速置于冰上3一5min。加入1mlLB振荡培养lh，30009离心5min，第二章茶树多酚氧化酶基因的克隆分子生物学研究的一个重要方面是研究基因的表达、调控、功能，其研究基础是必须获得该基因。同时对生物尤其是植物进行遗传工程操作也必须拥有基因，因而克隆基因成为分子生物学研究和生物遗传工程的重要基础工作之一。已经发展了多种的方法克隆基因，如利用已知的核普酸序列、已知的氨基酸序列、性状的差异表达、染色体库等。多酚氧化酶是参与植物体内次生代谢的酶类。多酚氧化酶对茶叶的品质影响很大，并且不同类型的茶叶要求不同活性的多酚氧化酶。红茶要求较高的酶活性，使得多酚类氧化生成红茶特有的色泽和香味。而绿茶则要求较低的酶活性，减少多酚类的氧化，以保持茶叶的绿色和鲜爽的特点。我们的研究希望能克隆茶树的多酚氧化酶基因，了解其表达的特点，以便能进一步对茶树进行遗传操作2.1材料和方法2.1.1材料试验所用的茶树品种为种植于本系华家池茶树种质资源圃的临海水古茶。取茶树幼叶，用液氮冷冻后置于一80保存待用。所用的分子生物学试剂如TRIzol试剂、PCR试剂、反转录酶、连接酶、内切酶、连接载体等分别购于华美、Sangon、GibcoBRL、Promega等公司。其余试剂如电泳用试剂、质粒碱法小量抽提试剂等用国产分析纯试剂配制。用于RNA操作的用具均用1%的DEPC处理后高压灭菌。其余用于DNA操作的用具亦高压灭菌处理。2.1.2方法茶树总RNA抽提进化树。软件来源于互联网。2.2结果和讨论2.2.1多酚氧化酶基因克隆以eDNA第一链为模板，以01190(dT)和sensel为引物进行PCR反应。经电泳检测，PCR产物为弥散状，未有条带出现。将第一次的PCR反应产物经适当稀释后作为模板，以antisense和sense工I为引物，进行nest一PCR反应，电泳后发现在Ikb左右处有一条带。经连接、转化、扩增、质粒提取和酶切鉴定后，进行序列测定。序列测定图见图2.1和2.2。经过序列分析软件将测定的序列比较拼接，并经过在互联网上比较确证，得到了茶树中多酚氧化酶基因的部分序列，其长度为1006个碱基。并将核营酸序列按三种不同的起始位置翻译成氨基酸序列，经过比较，最后确定正确的氨基酸序列，其长度为335个氨基酸残基。从这个序列中可以发现多酚氧化酶中两个铜离子结合位点均在所克隆的片段中。该基因的部分序列己经在GenBank中登录，登录号为AF269192。2.2.2核营酸序列比较用ClustalW将茶树多酚氧化酶基因与己经登录于GenBank中植物的多酚氧化酶基因的核普酸序列进行多重比较(表2.1)，可以发现茶树多酚氧化酶基因与一些木本植物的序列一致性比较大，如葡萄、苹果、商陆、杏等，但与蚕豆、番薯等草本植物也有比较高的相似性。说明植物之间的多酚氧化酶基因的序列差异不大，在植物的进化过程中比较保守。但也有例外，如甘蔗与其它植物相比较，其序列差异比较大。这主要是由于甘蔗是属于C4植物，而其它植物均为C3植2.2.3氨基酸序列比较对多酚氧化酶部分氨基酸序列进行多重比较发现(表2.2)，这300多个氨基酸中，有30多个在所比较的23个序列中完全一致，占10%左右。另外还有10%左右氨基酸其侧链的性质相同。从这些氨基酸的分布位置看，多酚