酸性蛋白酶菌株筛选及发酵条件优化.doc

湖南农业大学全日制普通本科生毕业论文（设计）开题报告学生姓名时晨学 号200742145330年级专业及班级2007级生物工程（3）班指导教师及职称林元山 副教授学 院生物科学技术学院2010 年 12 月 20 日毕业论文（设计）题目产酸性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件的研究文献综述（选题研究意义、国内外研究现状、主要参考文献等，不少于1000字）1. 研究意义酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.55.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。 细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。2. 研究现状2.1国外现状国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。2.2国内现状与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究.戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。2008年王云等，通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究，国内仅仅集中于凝乳酶和胃蛋白酶方面，有关真菌酸性蛋白酶的分子生物学研究报道很少。3. 实验条件保障学校实验室仪器设备齐全。学校实验室有高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌锅、生物安全柜、超净工作台、15L 100L发酵罐等各类仪器设备及各类实验仪器，基本满足本实验所需条件。林元山老师所带领的队伍，对与发酵相关的项目已进行较长实验，取得阶段性进展。不断完善的设备工艺和摸索出的实践经验是项目顺利进行保证。有了学校完备的实验条件，有了资深导师的带领，有了我们学生严谨、认真、踏实的实验，这项具有科技探索性、创新性、开发性的综合研究项目一定可以成功。4. 主要参考文献1 张美香等.微生物源酸性蛋白酶的研究进展J.河南工业大学学报:自然科学版,第30卷第6期.2 李永泉等.曲霉L336酸性蛋白酶发酵过程动力学研究J.浙江大学学报:理学版2000(2):18-13.3 戚淑威,黄遵锡.青霉P21007产酸性蛋白酶的条件和酶学性质J.中国酿造,2006,8(2):23-29.4 王彦荣,孟祥春.酸性蛋白酶生产与应用的研究J.酿酒科技,2003,5(3):35-40.5 沈玉洁,张明春等.高产酸性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件的优化J.食品发酵与科技,第46卷第6期. 6 R.E.布坎南,N.E.吉本斯等.伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)M.北京:科学出版社7 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册M.北京:科学出版社8 Malab R, Aparnam T, Mohinis G, et al. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteasesJ.Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62 ( 3 ) :597-635.9 Boekhorst J, Siezen R J, Zwahlen M C. The completegenomes of Lactobacillus plantarum and Lactobacillusjohnsonii reveal extensive differences in chromosomeorganization and gene content J. Microbiology, 2004,150:3601-3611.10 Christop H, Utz Reichard, Michel Monod.Secreted Aspartic Proteinase Family of Candi2da tropica lis J.Infection and Immunity,2001, 69 (1) : 402-412.11 王云,曾沃坦,钱世凯.黑曲霉Aspergillusniger H菌株所产酸性蛋白酶的质谱法鉴定及酶学特性J.食品工业科技,2008,9(27):33-41.研究方案（研究目的、内容、方法、预期成果、条件保障等）材料和方法1. 材料1. 1 供试材料九教及草莓园取土样并以取样地点标号土样. 1. 2 培养基分离培养基 酸性蛋白酶初筛培养基 三角瓶固料复筛培养基发酵培养基 1. 3 主要试剂 干酪素0.4%,KH2 PO4 0.03%,MgSO47H2 O 0.05%,FeSO47H2 O 0.0002%,NaCl0.1%ZnSO4 0.003%,无水CaCl2 0.0002%,琼脂2%,pH 6.5-7.0，121,灭菌20min.麸皮55%,黄豆45%,保持培养基含水量为固料,水为10.7,装湿料20g,121,灭菌20min.蒸馏水。1. 4 主要设备 CRDX-280型不锈钢电热手提式灭菌消毒器（上海申安医疗器械厂），TH2-98台式恒温振荡器（常州诺基仪器有限公司），303S-0型电热恒温培养箱（上海康路仪器设备有限公司），202V1恒温干燥器（上海实验仪器总厂），YJ-875单人垂直净化工作台(苏州工业园区三兴净化科技有限公司)，WZZ-2B自动旋光仪（数显）（上海精密仪器仪表有限公司），KDN-04A凯氏定氮仪(上海洪纪仪器设备有限公司), DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密实验设备有限公司），UV-9100紫外可见分光光度计（北京科瑞海科学仪器公司），PL303电子天平（上海梅特勒-托利多集团），SHA-C水浴恒温振荡器（华普达教学仪器有限公司），FW100型高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），BCD-196T XZ冰箱（海尔集团），JYD-C12P87 豆浆机（九阳股份有限公司） 2. 方法2.1 原材料的获得2.2 土样处理：称取5 g 土样放入250mL三角瓶中加入葡萄糖5 g, 无菌水45mL, 150 r/ min 摇瓶培养24 h。稀释平板: 高氏一号合成培养基中放入重铬酸做抑菌剂, 使其浓度为0. 005%,培养液用无菌水稀释至10- 3、10- 4、10- 5，做倾注培养, 每份样品2个平皿, 放入电热恒温培养箱, 培养5-7 d。挑出单菌落,再接种到平板中进行划线分离, 定期镜检观察, 直至菌落特征和菌体特征均一, 得到单一的菌落,从而进行下一步的鉴定。2.3 菌种初筛将分离的高温菌点种于酸性蛋白酶培养基上，50培养12h后，观察水解圈大小，初步筛选出产酸性蛋白酶优良的菌株2.4 三角瓶复筛取初筛的菌株，接种三角瓶固料培养基，50培养48h。称取2.0g固体曲，研磨后用20mL 0.1 mol/L pH3.0的乳酸-乳酸钠缓冲剂，在40水浴中浸提1h，并间断性搅拌，经滤纸过滤后即得粗酶液。2.5 发酵培养基最佳发酵条件研究挑取一环活化后的菌株于种子培养基，50条件下，摇床培养一定时间，再按一定接种量接入250 mL三角瓶固体发酵培养基。2.6 记录不同的碳氮比，初始pH值，培养温度，发酵时间，接种量对发酵的影响进程计划（各研究环节的时间安排、实施进度、完成程度等）工