食品微生物检验学.doc

食品微生物检验学二、食品微生物检验学1、概念食品微生物检验学是运用微生物学的理论与技术，研究食品中微生物的种类、特性等，建立食品微生物学检验方法和确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性科学。2、特点1)研究对象以及研究范围广:食品种类多，各有特色，分布不同；微生物的种类非常多，数量巨大；在食品来源、加工、运输等都可能受到各种微生物的污染。2)涉及学科多样 :涉及生物学、生物化学、工艺学、发酵学等方面的知识，以及兽医学方面的知识等。3)实用性及应用性强:在促进人类健康方面起着重要的作用。检验利用、控制微生物防止食品变质和杜绝因食源性病害保证食品卫生的安全。4)采用标准化(受法规约束):中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法是法定的检验依据。3、目的 为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据，保证人类获得符合卫生要求、适于人类消费的食品。4、食品微生物检验学的任务1)研究各类食品中微生物种类、分布及其特性2)研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的卫生质量3)研究微生物与食品保藏的关系4)研究食品中的致病性、中毒性、致腐性微生物5)研究各类食品中微生物的检验方法及标准5、食品微生物检验的发展食品微生物检验学的发展是与整个微生物学的发展是分不开的。人类很早就开始利用微生物的许多特性为人类的生产、生活服务，古代人类早已将微生物学知识用于工农业生产和疾病防治中，公元前二千多年的夏禹时代，就有仪狄酿酒的记载。北魏(公元386534年)齐民要术一书中详细记载了制醋的方法。长期以来民间常用的盐腌、糖渍、烟熏、风干等保存食物的方法，实际上正是通过抑制微生物的生长而防止食物的腐烂变质。在预防医学方面，我国自古就有将水煮沸后饮用的习惯。明朝李时珍在本草纲目中指出，将病人的衣服蒸过后再穿就不会传染上疾病，说明已有消毒的记载。1)致病菌检测阶段微生物的发现：首先观察到微生物的是荷兰人吕文虎克(Antory Van Leeuwenhoek，16321723)。他于1676年用自磨镜片制造了世界上第一架显微镜(约放大300倍)，并从雨水、牙垢等标本中第一次观察和描述了各种形态的微生物，为微生物的存在提供了有力证据，并确定了细菌的三种基本形状：球菌、杆菌和螺旋菌，吕文虎克也被称为显微镜之父。微生物与食品腐败：法国科学家巴斯德(Louis Pasteur,18221895)首先实验证明有机物质的发酵与腐败是由微生物作用的结果，而酒类变质是因污染了杂菌，从而推翻了当时盛行的自然发生说。巴斯德病原体研究和预防方面也作出了卓越的贡献，他发明了巴氏消毒法，被称为现代微生物学之父。病原微生物：19世纪末至20世纪初，在巴斯德和科赫光辉业绩的影响下，国际上形成了寻找病原微生物的热潮。有关食品微生物学方面的研究也主要是检测致病菌。我国从50年代起开始对沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌等食物中毒菌进行调查研究，并建立了各种食物中毒的细菌分离鉴定方法。2)指示菌检测阶段在我国，80的传染病是肠道传染病，为了预防肠道传染病，各种食品微生物的检验方法和检验标准的制定，是食品微生物检验的重要研究内容之一。通过这些方法和标准，可以检测并判断水、空气、土壤、食品、日常用品以及各类公共场所的安全卫生状况。但是，直接检测目的病原微生物，难(why?)需寻找带有指示性的微生物(指示菌) 根据其检出情况，判断样品被污染程度，并间接指示致病微生物有无存在可能，以及对人群是否构成潜在威胁。指示菌(Indicator Organism)：是在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。检验指示菌的目的，主要是以指示菌在检品中存在与否以及数量多少为依据，对照国家卫生标准，对检品的饮用、食用或使用的安全性作出评价。这些微生物应该在环境中存在数量较多，易于检出，检测方法较简单，而且具有一定的代表性。指示菌可分为三种类型：A 评价被检样品一般卫生质量、污染程度以及安全性的指示菌最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数。B 粪便污染的指示菌主要指大肠菌群。其他还有肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等。其检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性。C 其他指示菌包括某些特定环境不能检出的菌类，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。3)微生态制剂检测阶段19世纪人们就发现并开始认识厌氧菌(巴斯德，1863)，但直到20世纪70年代了解到厌氧菌主要是无芽孢专性厌氧菌后，才开始重新重视其研究。厌氧菌广泛分布在自然界，尤其是广泛存在于人和动物皮肤和肠道。生态平衡时，与人和动物体“和平共处”。生态失调时，成为条件致病菌(opportunistic organism)，形成厌氧菌感染症。由此，市场上出现了以乳酸菌、双歧杆菌为主的各种微生态制剂后(1980s以来)，检验其菌株特性和数量就成了目前食品微生物检测的一项重要内容。4)现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测转基因动物、植物和基因工程菌被批准使用以及进入商品化生产，加大了食品微生物检测的任务。目前也发现了一些尚未能培养的微生物，这也促进了食品微生物检验技术的发展。在微生物应用技术、实验方法方面也有极其迅速的发展。如电镜技术的进步，并结合生物化学、电泳法、免疫化学等的技术，推动了对微生物的分类和鉴定。荧光抗体技术、单抗技术、PCR技术等，也进一步促进了微生物检验的发展。6、我国食品微生物检验机构1)进出口检验 国家质量监督检验检疫总局2)国内检验 中国疾病预防控制中心(CDC)营养与食品安全所是我国食品卫生检验评价的权威机构。 食品卫生监督机构：各级卫生局下属 卫生监督所 屠宰检验：兽医卫生监督所+单位自检 食品加工企业自检食品微生物检验学作为给人类提供有益于健康、能确保食用安全的食品的科学保障之一，业已受到人们的重视，有着广阔的发展前景。第一章 微生物检验鉴定技术第一节 微生物检验基本知识包括显微镜检、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等一、接种(inoculation)将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。1. 接种工具 接种针 接种环 接种钩 玻璃涂棒 接种圈 接种锄 小解剖刀2. 常用的接种方法 有以下几种：1)划线接种 最常用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。2)三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。3)穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常用。用的接种工具是接种针。培养基一般是半固体培养基4)倾注接种 该法是将待接种微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，以达到稀释菌液的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。5)涂布接种 先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，使菌液均匀分布，即可长出单个菌落。6)液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中；或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，都属于液体接种。7)注射接种 用注射的方法将微生物转接至活的生物体内，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种。8)活体接种 是专用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式有注射、灌喂、拌料喂养等。3. 无菌操作(Aseptic technique)培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具(如接种针和吸管等)在无菌条件下接种含菌材料(如样品、菌苔或菌悬液等)于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。 在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。二、分离纯化(Isolation)含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物(Mixed culture)。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养(Pure culture)。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。1、倾注平板法( Pour plate ) 2、涂布平板法(Spread plate)3、平板划线法(Streak plate)常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。4、富集培养法富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其它微生物。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。5、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把它放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌石蜡于培养基表面，使与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。三、培养1、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养。好氧培养(Aerobic Incubation) ：也称“好气培养”。 厌氧培养(Anaerobic Incubation)：也称“厌气培养”。2、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类：固体培养：solid incubation 液体培养：liquid incubation第二节 微生物常规鉴定技术一、形态结构和培养特性观察1、微生物的形态结构观察微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。2、微生物培养特性观察革兰染色法，丹麦病理学家C.Gram 1884年创立(1)涂片 (2)晾干 (3)固定 (4)结晶紫色染色：1min。水洗 (5)媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。水洗(6) 脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。(7) 复染：滴加蕃红复染5min。水洗(8) 晾干：晾干或者用吸水纸吸干。(9) 镜检：先用低倍，再用高倍，最后用油镜。(10)实验完毕后的处理：浸过油的镜头：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。细菌染色玻片用废擦镜纸将香柏油擦干。微生物培养特性的观察是微生物检验鉴别中的一项重要内容。1)细菌的培养特征 包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。2)霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。二、生理生化试验微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。微生物检验中常用的生化反应有：糖或醇类发酵试验 淀粉水解试验 V-P试验 甲基红(MR)试验 靛基质(Indole)试验 过氧化氢酶试验 硝酸盐还原试验 明胶液化试验 尿素酶(Urease)试验 氧化酶试验 硫化氢(H2S)试验 三糖铁(TSI)琼脂试验 氨基酸脱羧酶的测定 耐盐性试验 卵磷脂酶的测定石蕊牛奶反应 酪蛋白水解 苯丙氨酸脱氨试验 氰化钾试验 对叠氮化钠的抗性硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验 含碳化合物的利用(柠檬酸盐或丙酸盐利用)三、血清学试验血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。在细菌的检测中，应用最多的是凝集试验、沉淀反应和补体结合试验。血清学试验的一般特点：1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。3)抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。1、凝集反应(Agglutination reaction)颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。1)直接凝集反应：a. 玻片凝集法； b. 试管凝集法 2)间接凝集反应2、沉淀反应(Precipitation test)可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。1)环状沉淀反应 2)絮状沉淀反应3)琼脂扩散试验3、补体结合反应(Complement fixation reaction)补体结合反应是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象; 如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，如果出现溶菌，说明抗原抗体是相对应的(试验结果阳性)；如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应(阴性)。此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。其它方法：荧光抗体技术, ELISA, 免疫组化第二章 食品微生物检验的一般程序第一节 食品检验样品的采集采样(Sampling)从产品中抽取少量的、有一定代表性的样品，供检验分析用，这一过程称为采样 。一、食品检验样品采集的原则1. 采样前的一些准备工作 干冰：制冷剂。也可以用湿冰。 盒子或制冷皿：贮藏、运输样品。 灭菌容器：从塑料袋到灭菌的加仑漆桶等。 取样工具：茶匙、角匙、尖嘴钳、镊子、 量筒和烧杯等。 灭菌手套： 无菌棉拭子：一般用于拭取仪器设施和工厂环境区域。 灭菌全包装袋：装样品用。 当样品收集时，样品采集时的条件例如产品的温度、地点等，连同扦样样品号唛头，一并记录入检验员的注释说明中。 当采集无菌样品时，一条最重要的规则是：千万别污染样品。这需要样品采集人非常小心地采集所有附加样品，确保不违反这条规则。2. 食品检样采集的原则1)所采样品应具有代表性。2)采样必须符合无菌操作的要求，防止一切外来污染 一件用具只能用于一个样品，防止交叉污染。3)在保存和运送过程中应保证样品中微生物的状态不发生变化 采集的非冷冻食品一般在05冷藏，不能冷藏的食品立即检验。一般在36h内进行检验。4)采样标签应完整、清楚 每件样品的标签须标记清楚，尽可能提供详尽的资料。二、食品检验样品的采集方法一)取样方案一般说来，进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按合同规定抽样；无具体抽样规定的，可根据检验目的、产品及被抽样品的性质和分析方法确定抽样方案。目前最为流行的抽样方案为(国际食品微生物学标准委员会)ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方案。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于8件。二)样本选择三)抽样(采样)方法国际食品微生物标准委员International Commission on Microbiological Specifications for Foods， ICMSFICMSF方法是从统计学角度来考虑，对一批产品检查多少个检样才能够有代表性，才能客观地反映该批产品质量的设想采样的ICMSF提出的采样基本原则，是根据以下考虑来规定不同的采样数:(1) 各种微生物本身对人的危害程度各有不同；(2) 食品经不同条件处理后，其危害程度可分为3种情况：危害度降低；危害度未变；危害度增加。ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的 。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。ICMSF的采样方案:ICMSF方法中包括二级法及三级法2种。二级法只设有n、c及m值，三级法则有n、c、m及M值。 n：系指一批产品的采样个数。 c：系指该批产品中检样菌数超过限量的检样数。 m：系指合格菌数限量。 M：系指附加条件后判定为合格的菌数限量 。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。1)二级法：只设定合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。通过检查在检样中是否有超过m值的，来判定该批是否合格。如生食鱼片中细菌总数标准为n=5，c=0，m=100cfu / g。其中m=100cfu / g即为限量标准，n=5即取样5个，c=0即表示在该批5个检样中，若未见有超过m值为100cfu / g的检样，则该批产品为合格品。cfu：colony forming unit, 菌落形成单位2)三级法：设有微生物标准值m及M值，如同二级法，超过m值的检样为该检样不合格。所有检样均小于m值，该批产品为合格；在m值到M值范围内的检样数在c值范围内，即为附加条件合格，否则为不合格；凡有检样超过M值者，则该批产品为不合格。如澳大利亚冷冻糖制食品的大肠菌群标准为n=5，c=2，m=100，M=1000，其含义是从一批产品中，取5个检样，若所有检样大肠菌群结果均小于m=100，则判定为该批产品合格；若2个检样的结果位于m与M值之间(即1001000之间)，则判定为附加条件合格；若有3个及以上检样的结果位于m与M值之间，判定为该批产品不合格；若有任一检样大肠菌群数超过M值(即1000)者，则判定该批产品不合格。表3-1 ICMSF按微生物的危害度及食品处理进行情况分类二)样本选择样本选择可以分为有针对性选择和随机选择两种。1、在现场抽样时，可利用随机抽样表进行随机抽样。2、有针对性选择是根据已掌握的情况，如怀疑某种食物可能是食物中毒的原因食品，或者感观上已初步判定出该食品存在卫生质量问题，而有针对性地选择采集样本。三)抽样(采样)方法随机采样，即用一种能使总体的每一部分有同等机会出现在样品中的方法，从大批样品中抽出若干部分。代表性采样(针对性采样)，即使用系统抽样法采样，以使所取的每一部分代表食品的相应部分。随机抽样表系用计算机随机编制而成，包括1千、1万或10万个数字。其使用方法如下：a.先将一批产品的各单位产品(如箱、包、盒等)按顺序编号。如将一批600包的产品编为1、2600。b.随意在表上点出一个数。查看该数字所在的行和列。如点在第18行、第10列的数字上。c.根据单位产品编号的最大位数(比如，最大为三位数)，查出所在行的连续列数字，则编号与该数相同的那一份单位产品，即为一件应抽取的样品。d.继续查下一行的相同连续列数字。该数字所代表的单位产品为另一件应抽取的样品。e.依次按上述方法查下去。当遇到所查数超过最大编号数量，则舍去此数，继续查下一行相同列数，直到完成应抽样品件数为止。三)抽样(采样)方法1)、重量法 采取一定重量的食品作为一个样品。采取屠宰后两腿内侧肌或背最长肌100g/只；蛋、蛋制品样品，每份不少于200g。2)、拭子法 拭子法采样不损害肉的完整性，操作简便。但是检出的活菌总数不高。3)、灌洗法 对于全净膛光禽最好在洗涤后立即采样。本法比拭子法检出率高。抽样方法对抽样方案的有效执行和保证样品的有效性代表性至关重要。抽样必须遵循无菌操作程序，抽样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。抽样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。 应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。微生物检验时样品的制备 均匀食品：用四分法缩分；肉类、水产类食品：灭菌剪刀剪碎，四分法缩分。第二节 食品检验样品的运送及处理一、样品的标记抽样过程中应对所抽样品进行及时、准确的标记；抽样结束后，应有抽样人写出完整的抽样报告，使样品尽可能保持在原有条件下迅速发送到实验室。1 所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应记明产品标志与号码和样品顺序号以及其他需要说明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。2 当样品需要托运或由非专职抽样人员运送时，必须封识样品容器。二、样品的保存和运送一)样品保存的目的:都是必须尽大可能地保持其原有的状态和特性，尽量减少其离开总体以后的变化 。二)样品保存的原则:1. 防止污染；2. 防止腐败变质；3. 防止病毒死亡；4. 稳定水分；5. 固定待测成分。三)样品保存的方法净：指采集样品的一切工具、容器必须清洁干净或无菌，并特指不含有待测定目的物质；净也是防止污染和腐败变质的措施。密：指样品应密闭保存，它是稳定水分，防止挥发性成分损失以及避免污染的措施。冷：指样品应冷藏运送和保存(如果样品为测定病毒用时，则应冷冻或加50%的甘油生理盐水保存运送)，目的是降低样品内部的化学反应速度、抑制酶的活性和细菌的生长繁殖，同时也可减少高温和氧化损失。快：指快采、快运、快藏、尽快分析，尽量缩短样品在各个环节的停留时间。三、微生物检验时样品的预处理微生物检验主要是检查细菌和病毒等在食品中的数量或它们对实验动物的致毒、致病能力，微生物必须“活着”或者必须有“活力”。样品预处理方法以不破坏微生物的活力和毒素，使微生物和毒素从食品中充分溶出为准则。一） 细菌检样的预处理 方法：振摇、振荡、搅拌和均质均质法的优点：1)可以使细菌从食品颗粒上脱落下来；2)可以使细菌在液体中分布均匀；3)使食品中的营养物质更多地释放到液体中，有利于细菌的生长繁殖 。均质法：1)破碎式 2)冲击式 3)蠕动式检样的稀释 检样可用灭菌生理盐水、缓冲液或相应的培养基来稀释。二)病毒检样的预处理 病毒检样多采用的是冷冻保存或加50%的甘油生理盐水保存。 有些检样可能受细菌的污染较重，因此在检样接种前，应做除菌处理 动物性食品检验的目的就是根据所的出的检验结果对被检食品的品质和质量做出正确的客观的判断和评价。由于不同的检验方法存在着灵敏度、准确度、精密度和适应不同条件的测定等方面的差异，所以不同的检验方法和操作过程就可能得出不同的检验结果。因此，必须有一种固定的统一的检验方法和操作规程，以便得出较为统一的结果 。 国家规程、进出口检验规程第四节 分析数据处理 与检验方法一样，也是在制订卫生标准的同时就规定的：1、有效数字2、运算规则3、直线回归方程的计算4、精密度和准确度第五节 检验报告动物性食品检验的最后一项工作是检验报告，也是一项重要的工作。它不但关系到这批食品的命运，关系到人民的健康，同时也关系到食品进出口的信誉问题。因此，在填写检验报告时，一定要实事求是真实无误；同时要熟悉我们国家和国际食品卫生指标，按食品卫生指标进行仲裁。第三章 食品微生物检验的指标重点和难点： 菌落总数 卫生学意义及常规检验方法 大肠菌群MPN 卫生学意义及常规检验方法 致病性微生物 卫生学意义及常规检验方法制订食品卫生标准目的：促进工农业生产、保障人体健康及维护国家的尊严和利益。意义 由于食品卫生标准具有一定的社会政治性。食品卫生标准往往被用作食品贸易中类似于关税壁垒的控制手段，籍此可以“名正言顺”地限制各国所谓的不合格食品的输入，或籍此迫使出口国降价出售。 技术贸易壁垒(TBT)第一节 菌落总数一、菌落总数的概念及卫生意义1. 概念 菌落(colony)是指一个或几个相同的细菌在固体培养基上增殖而形成的肉眼可见的细菌集团。它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。 菌落总数(colony count)是指食品检样经过处理，在一定的条件下(样品处理、培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧条件)培养后，所得到的每单位食品(1g，1mL，1cm2)中所含细菌菌落的总数。由于菌落总数测定是在需氧条件下进行的，而且不能区别细菌种类，因此，菌落总数又称为需氧菌数(aerobic bacterial count)或杂菌数。辨析：菌落总数与细菌总数细菌总数：指一定数量或面积的食品样品经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1mL或lcm2 样品中的细菌总数来表示。菌落总数测定的是活菌数，现在通常用 cfu/(g，mL，cm2)表示。菌落总数更具有食品卫生学意义。Why？2. 测定意义 菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标志，也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中的繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。 另外，测定食品中的菌落总数也可对这种食品的质量作出预测。如菌数在105CFU/cm2的牛肉在0时可保存7d，而菌数为103 CFU / cm2时，在上述条件下却可保存18d；有的食品当细菌数达到106107 CFU /g时，即能从感官上发现变质。有人认为，菌数达106107 CFU /g的食品即可能引起食物中毒。品种 表 3-1-1 我国食品卫生标准(部分) 菌落总数 大肠菌群MPN 出厂 销售 出厂 销售肉灌肠 2104/g 5104/g 30/100g 30/100g烧烤肉 5103/g 5104/g 40/100g 100/100g辐照扒鸡 500/g 30/100g熟肉制品 500/g 30/100g肉松 3104/g 40/100g含乳蛋10%以上 2.5104/mL 450/100mL的冷冻食品含乳蛋10%以下 104/mL 250/100mL的冷冻食品肉干、肉脯 104/g 30/100g 烤鱼片 3104/g 30/100g 二、菌落总数的常规检验方法中华人民共和国标准食品卫生微生物学检验 菌落总数测定(GB/T 4789.2-2003)基本操作一般包括：样品的稀释倾注平皿培养48(24)h计数报告。1. 检样稀释及培养(1)以无菌操作，将检样 25 g(或 25 mL)剪碎放于含有225 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体样品在加入稀释液后，最好置均质器中以8 000 r/min10 000 r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。(2)用1 mL灭菌吸管，吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1:100倍的稀释液。(3)另取l mL灭菌吸管，按上条操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1 mL灭菌吸管。(4)根据食品卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择2个3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度作2个培养皿。(5)稀释液移入培养皿后，应立即将冷至46 左右营养琼脂培养基(可放置于461水浴中保温)注入培养皿约15 mL，并转动培养皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有l mL灭菌稀释液的灭菌平皿内作空白对照。(6)待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养48h2h。2. 菌落计数方法作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜观察，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。3. 菌落计数的报告(1)平板菌落数的选择：选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。(2)稀释度选择选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表3-1-2例1)。若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其较小的数字(见例2及例3)。若所有稀释度的平均菌落数均较大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见例4)。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见例5)。若所有稀释度均无菌落的生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见例6)。若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以其稀释倍数报告之(见例7)。(3)菌落数的报告：菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示，详见表3-1-2。表3-1-2 稀释度选择及菌落总数报告方式三、菌落总数的其它检验方法1. 平板表面涂布法将营养琼脂制成平板，经50 1h2h或35 18h20h干燥后，于其上滴加检样稀释液0.2mL，用“L”棒涂布于整个平板的表面，放置片刻(约10min)，将平板翻转，移至361温箱内培养242h(水产品用30培养482h)取出，按常规法进行菌落计数，然后乘以5(由0.2mL换算为1mL)，再乘以样品稀释液的倍数，即得1g或1mL 检样所含菌落数。此法较常规法为优，因菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆，同时还可以使细菌免遭融化琼脂的热力伤害，不致因此而使细菌细胞受损而不生长，避免了由于操作过程中的不良因素使检验中的细菌菌落数降低。但本法取样量较常规法少，其代表性将受到一定的影响。2. 平板表面点滴法与涂布法相似，不同的只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(每滴相当于0.025mL)将检样稀释液滴加到琼脂平板上固定的区域(预先在平板背面用记号笔划成四个区域)，每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行实验。滴加后，将平板放置片刻(约5min10min)，然后翻转平板，如前移入温箱中培养6h8h后进行计数，将所得菌落数乘以40(由0.025mL换算为1mL)，再乘以样品的稀释倍数，即得1g或1mL检样所含的菌落数。第二节 大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义1.概念 大肠菌群(coliform group)是指一大群需氧或兼性厌氧、在37培养24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群并不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。 大肠菌群主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、枸橼酸菌属、肠杆菌属(产气杆菌属)克雷伯氏菌属的一部分细菌以及沙门氏菌属第亚属(能发酵乳糖)的细菌，此外还有来自土壤和植物的个别细菌(如欧文氏菌属)。 大肠菌群MPN(Most Probable Number)为最可能数，是应用统计学原理和方法，根据试验的阳性管数计算出样品中大肠菌群的含量，报告出每100mL(g)大肠菌群的最可能数。 粪大肠菌群，fecal coliform group 粪便来源的大肠菌群 (03新国标中有检验方法)2.意义：大肠菌群是作为粪便污染指示菌而提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品是否受到了人或温血动物粪便的污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，以及肠道致病菌对人体健康危害性的大小。作为粪便污染指示菌的条件：和肠道致病菌的来源相同，并且在相同的来源中普遍存在和数量甚多，以易于检出。在外界环境中的生存时间与肠道致病菌相当或稍长。检验方法比较简便。 最好的粪便污染指示菌是大肠杆菌。 各国根据自己的情况，有的用大肠菌群作食品受粪便污染的指标，有的使用粪大肠菌或大肠杆菌。二、大肠菌群MPN的常规检验方法1、检样稀释：以无菌操作，将检样 25 g(或 25 mL)剪碎放于含有225 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(内置适量玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体样品在加入稀释液后，最好置均质器中以8 000 r/min10 000 r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。根据国家或当地卫生标准要求及对样品污染程度的估计，连续做几个10倍递增稀释，并选择3个连续的稀释度，用于接种乳糖胆盐发酵管。2、乳糖发酵试验：接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。选择3个稀释度，每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管，置于361 培养482h，观察是否产气。不产气的管报告为大肠菌群阴性。3、分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361培养1824h，观察菌落形态。典型的大肠菌群菌落呈紫黑色并带有金属光泽或无光泽，而红色、粉红色菌落检出率较低。4、证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色镜检。同时接种乳糖发酵管361培养242h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、镜检为革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌者，即可报告为大肠菌群阳性。5、报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN表(见表3-2-1)，报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。根据试验的阳性管数计算出样品中大肠菌群的含量，报告出每100mL(g)大肠菌群的最可能数。具体操作参见GB4789.3-2003中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定。大肠菌群检验程序三、大肠菌群MPN的其它检验方法1. 疏水网膜法(hydrophobic grid-membrane filter, HGMF) 加拿大的Sharp AN博士等(1974)首次报道。其基本原理是：以疏水物质在5cm2、孔径为0.45m的滤膜上，横竖各刻印40条线，将滤膜分为1600个小格，以疏水线作为栅栏，防止菌落扩散。样品稀释液首先通过5m的前滤器过滤，再通过0.45m的HGMF滤膜过滤，然后根据所需检验菌的特性，将滤膜置于不同的选择培养基上培养24h48h，阳性菌落即可通过显色而进行鉴定，如果是大肠菌群则呈蓝色。根据阳性菌落数查“阳性菌落数与单位生长最近似值换算表”即可得出单位样品中大肠菌群的MPN。本法可在24h30h得出结果，大肠菌群准确率为100%，无假阳性。该法的优点在于：只使用单一的稀释度，大大减少了检验过程中的随机误差和系统误差；在过滤时除掉了所含的一些固体物质， 及一些不利于细菌生长的可溶性物质，便于细菌的生长；因为滤膜先在营养琼脂上培养4h5h，再转移到选择性培养基，使受伤细菌得以恢复，因此缩短了检出时间，提高了灵敏度。2. TTC显色法 该法使用的是含有TTC(氯化三苯四氮唑)的乳糖发酵培养基，接种方法与常规法相同。接种后于3537培养18h24h，观察TTC乳糖培养基的显色和产气现象来判断大肠菌群，然后根据阳性管数，查大肠菌群MPN检索表，报告大肠菌群数。3. DC半固体试管法 该法是将检样稀释成3个稀释度，分别接种于含有DC(去氧胆酸钠)的半固体培养基中，充分混合，待凝固后，放入37温箱内培养1824h，根据培养基的颜色和有无气泡的产生或琼脂崩裂现象来判断大肠菌群，并根据阳性管数查MPN检索表报告大肠菌群数。4. 纸片法 该法是将含有溴甲酚紫和TTC成分的培养基浸渍纸片，然后将稀释成三个不同稀释度检样分别涂布在三张纸片上，置361温箱中培养15h，根据纸片上菌落颜色和菌落周围纸片颜色来判断大肠菌群，并根据纸片的阳性片数，查大肠菌群MPN检索表进行报告。第三节 致病性微生物食品首先要求的是安全性，其次才是可食用性及其它。因此，食品中一旦有致病菌污染，其安全性就丧失了，食用性也就不复存在。致病菌与食品中毒和疾病发生是肯定和直接的。致病菌污染的食品不但对个人健康造成危害，对家庭和社会也会造成一定的危害。 各国卫生部门都对致病菌作了严格规定，把致病菌作为食品卫生质量的最重要的指标。 根据我国食品卫生标准规定，在所有食品中各相关致病菌不得检出。一、食品中存在的常见致病菌食品生产是一个时间长、环节多的复杂过程。总之，与食品有直接和间接关系的致病性微生物都可能污染食品。有时引起人类食物中毒的并不是致病菌本身，而是由它们所产生的外毒素或内毒素，也包括一些真菌等。1、能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物：沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。2、能产生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真菌，都会产生毒素。二、食品中致病性微生物的检验根据每种食品最可能污染的致病菌种类进行检验，如肉、蛋类食品以沙门氏菌检验为主，罐头制品以肉毒梭菌及其毒素检验为主，牛乳以结核杆菌和布氏杆菌为主，而水产品必须检验副溶血弧菌等。目前列入食品卫生国家标准的致病菌有13种，每种都有完整、详细的检验方法(03年新国标)。这些检验方法符合我国国情，同时与一些发达国家的检验方法基本上一致。第四节 霉菌和酵母计数一、霉菌和酵母的食品卫生学意义霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品正常菌相的一部分。某些霉菌和酵母的利用。在某些情况下，霉菌和酵母在食品中生长也可使食品腐败变质。还可破坏食品的色、香、味，使食品产生不良气味、颜色改变等。pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品中；低温贮藏食品；含有抗菌素而不适于细菌生长的食品。 霉菌和酵母能合成有毒的代谢产物(霉菌毒素)，可引起急性或慢性食源性疾病；黄曲霉毒素等霉菌毒素具有强烈的致癌性；或能促进病原菌生长。因此，霉菌和酵母也可作为评价食品卫生质量的指标之一，以霉菌和酵母菌数判断食品的污染程度。目前已有一些国家对某些食品制定了霉菌和酵母数的限量标准。二、检验 见国家标准 GB/T 4789.152003)1. 平板计数法 主要采用倾注培养菌落计数，方法和要求与细菌菌落总数测定相同，区别之处主要如下。(1)倾注培养用的培养基必须适合霉菌生长，而对细菌具有抑制作用。常用的选择培养基为孟加拉红(虎红)培养基、高盐察氏培养基或马铃薯-葡萄糖琼脂。(2)培养温度为2528，3d后开始观察，共培养观察7d。(3)霉菌的菌落比较大，在计数时选