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BrdU染色原理和步骤 YTH xianyuanruxia EdU染色方法简介 1 BrdU染色原理 BrdU 5 溴脱氧尿嘧啶核苷 是胸腺嘧啶的衍生物 常用于标记活细胞中新合成的DNA 可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中 细胞周期S期 这种掺入可以稳定存在 随着DNA复制进入子细胞中 BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入 从而判断细胞的增殖能力 BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入 从而判断细胞的增殖能力 2 活体注射或细胞培养后利用抗Brdu单克隆抗体 ICC染色 显示增殖细胞 同时结合其它细胞标记物 双重染色 可判断增殖细胞的种类 增殖速度 对研究细胞动力学有重要意义 因组织细胞内无内源性Brdu存在 所以Brdu应用较广掺入双链DNA内的Brdu 以氢链与腺嘌呤结合 不能直接与抗Brdu抗体反应 需经解链使Brdu暴露方能被染色 常用的解链方法为盐酸加热 蛋白酶处理等 使DNA双链部分单链化 抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合 再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育 呈色 显示进入S期细胞的情况 3 改进和发展 由于盐酸和蛋白酶处理等可引起抗原或组织形态发生变化 为此 Conchoroff 1985 等制备了一种单克隆抗体 Bu 1 其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应 因为培养液上清中含有DNA酶 可分解双链DNA 显露Brdu 达到染色目的 采用戊二醛固定后 胃蛋白酶 盐酸处理 亦得到了良好的染色结果 用双重或多重染色 观察何种细胞分裂增殖时 首先应染色其它抗原物质 最后显示Brdu 通常在第一种抗体呈色后 再经1 戊二醛固定5 10min 重复染色程序 均可获得较满意的染色结果 分裂细胞核呈棕褐色 显示其它抗原用ALP标记抗体 则细胞浆为红色 FR 或蓝色 FB 4 操作步骤 1 1 细胞以1 5 105 ml细胞数接种于直径35mm培养皿中 内放置一盖玻片 培养1d 用含0 4 FBS培养液同步化3d 使绝大多数细胞处于G0期 2 加入BrdU 储液 1 0mg ml 终浓度为0 03 g ml 37 孵育40min 3 弃培养液 玻片用PBS洗涤3次 4 甲醇 醋酸固定10min 5 5 经固定的玻片空气干燥 0 3 H2O2 甲醇30min灭活内源性氧化酶 6 5 正常兔血清封闭 7 甲酰胺100 5min变性核酸 8 冰浴冷却后PBS洗涤 加1抗即抗小鼠BrdU单抗 工作浓度1 50 阴性对照加PBS或血清 9 按ABC法进行检测 苏木素或伊红衬染 在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数 计算标记指数 LI 6 BrdUstainingprotocol MaterialsandreagentsHydrogenchloride HCl 1Mand2MBoratebuffer0 1MBorax sodiumtetraborate 38 1g liter pHto9 0Phosphate bufferedsaline PBS pH7 4 with0 1 TritonX 100 7 Method 1 Sectionsofparaffin embeddedtissuesshouldbede waxedbeforeproceeding 2 IncubateinHCl 1M for10minonicetobreakopentheDNAstructureofthelabeledcells 3 ThisisfollowedbyHCl 2M for10minatroomtemperature then20minat37 C 4 Immediatelyaftertheacidincubations neutralizebyincubatingthesamplesinboratebuffer 0 1M for10minatroomtemperature 5 WashinPBS pH7 4 0 1 TritonX 1003times 5minperwash 6 Continuewithstandardstainingprocedureasdescribedintheimmunohistochemistryandcytochemistryprotocols 8 注意事项 1 BrdU配制方法 10mg溶于10ml双蒸水 4 下避光保存2 BrdU会肌体造成不可逆损伤 使用时注意安全 避免吸入BrdU粉尘 9 BrdU染色的进化 EdU EdU 5 Ethynyl 2 deoxyuridine 是一种胸腺嘧啶核苷类似物 其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见 能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶 T 渗入正在合成的DNA分子中 基于Apollo 荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性 广泛应用于细胞增殖 细胞分化 生长与发育 DNA