RACE不用试剂盒.doc

5race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法那个试剂盒很坑爹的，价格高的离谱。其实在实验过程中完全没有必要买试剂盒，下面我来告诉你怎么玩。原理：5race的关键目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。方法就是在反转录的过程中人为的在5端加上接头，然后利用接头上面的特异序列作为引物和你已知序列上面的一段引物扩增cDNA片段，就能得到5未知序列片段。方法：在反转录的过程中加入5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3这个接头引物。在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。为什么？MMLV反转录酶有一种特性就是在反转录到序列末端的时候加上三个C来终止这个反转录过程，利用这添加上去的CCC和上面给你的那个接头引物的GGG碱基配对，MMLV就会以上面那个引物为模版将反转录出来的第一链继续延伸出接头引物的互补链，从而形成一个带接头的cDNA 5-末端。这个就是RACE的核心原理。具体不明白的看看这篇说明书就好，GOOGLE一搜，结果满天飞的，我就不给你传文件了。SMART RACE cDNA Amplification Kit User Manual你肯定有一下问题1.上面给你的那个接头引物能不能换掉。上面那个引物看起来好像很普通，其实里面大有玄机，如果你用DNAMAN软件预测一下引物的二级结构就可以发现，这个引物自身能形成一个类似老虎钳子的形状，而且仅仅只有GGG三个核苷酸暴露在外面用来和MMLV添加出来CCC配对。所以这个引物的设计是非常巧妙的。不建议你更换，而且你换掉以后自己要在你实验动物的基因组中验证是否存在相同或互补序列，这也是另一个问题。2.是不是用普通的方法合成该接头引物即可。答曰，可以。clontech公司提供的试剂盒里面的这段引物其实并非全是单链DNA，用于配对的那关键的GGG用的是RNA单链，为什么？原因是DNA-RNA的结合能力强于DNA-DNA。明白了把，所以那个用来坑中国人钱的试剂盒提供的引物是很容易降解的，一旦那三个G降解掉了，好了，这8K+盒子就报销了。值得庆幸的是用全DNA引物是完全能满足RACE需求的。所以，随便找个单位合成一下这引物就可以了。3.是不是所有的反转录酶都可以答曰，不是。RACE的核心技术就是MMLV延伸的CCC。别的酶不具有这种特性。4.其他方法其他方法有很多，例如传统的方法，那种利用5帽子结构筛选完整mRNA然后去帽子加接头的方法肯定是最好的。因为严格的说只有这种方法做出来的才真正称得上是准确的RACE。但是，同学，这方法麻烦，而且，价格不菲。这个贵是很有道理的，里面那么多种酶呀5.实验要求RNA的质量一定要好，越少的末端降解你得到的5RACE结果就是越准确的。6.中间已知序列特异性引物的设计，这个很容易，用primer 5 在已知序列里面随便挑一个分数高点的一般就行，实在不放心的话可以和接头引物配下对，看看有无引物二聚体，根据经验，一般没有。3-RACE相对来说要好做的多，以前我也用宝生物的试剂盒，没出过问题。但现在都是直接合成引物，反转录后直接扩增，现在告诉楼主一种新方法：QT：CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTT TTTTTTTQ0：CCAGTGAGCAGAGTGACGQ1：GAGGACTCGAGCTCAAGC因为RNA的3末端加有polyA尾巴，用上面加一通用引物的QT引物做反转录，也即取代之前的Oligo dT，得到的cDNA除了有poly(T)外，还有两个通用引物，然后用Q0作外向PCR，Q1做内向PCR，上游引物用你的基因特异性引物就行了。SMART 5-RACE的原理是先是利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)18MN作为锚定引物在反转录酶M-MLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物（例如 5 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3）配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（Universal Primer）（例如5 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3）作为上游引物，用一个基因特异引物2（Gene Specific Primer 2，GSP2）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模