大肠杆菌DH5a感受态细胞转化率的改进.doc

大肠杆菌DH5感受态细胞转化率的改进桓明辉摘要：针对实验材料Ecoli DH5，对该茵株在不同生长时期的转化效率进行测定，确立了一个能制备高转化率感受态细胞的实验方案。结果表明：在细茵的生长繁殖过程中，其转化率有很大变化；结果：得到了Ecoil DH5茵株制备感受态细胞的最佳条件。关键词：大肠杆茵；感受态；转化率DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的半乳糖苷酶氨基端实现互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验室频繁使用的一项重要的常规操作。对细菌而言，为达到高效转化，活细胞数务必少于l08细胞m1。对于大多数E.coli来说，相当与OD600为0.4左右，但由于转化是一个很复杂的过程，具体的作用机理仍在探究中。有文献指出1，细菌的最佳感受态细胞制备期对于不同菌株是不同的，并不一定都是在活细胞浓度为l08细胞ml的时候最适宜，有必要针对所使用的菌株确定其最佳转化条件。1 材料与方法1.1 材料与试剂菌株与质粒：Ecoli DH5，pUC18质粒由本实验室保存。X-gal，IPTG，LB培养基，氨苄青霉素溶液，0.1 molL CaCl2溶液，均按分子克隆实验指南的要求配制。 1.2 方法1.2.1大肠杆菌生长情况的测定：从平板上挑取单个菌落(直径23 mm)到含有30ml LB培养基的锥形瓶中，37下250 rmin培养过夜。取出0.3 ml培养物到含有l5 ml LB培养基的摇菌试管中，继续振荡培养，每隔20 min取出一支摇菌试管，放于冰箱统一测定菌液的OD600，绘制生长曲线。选取几个不同时相的菌液倍比稀释从lO-1 lO-6，各取0.1 ml稀释液涂布LB平板培养基，37正向培养1 h后，倒置培养l216 h。每个稀释度铺3个平板，计数，作OD600一活菌细胞浓度图。1.2.2 标准质粒制备4利用裂解法抽提pUC18质粒，琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察，将显示为超螺旋DN带型的凝胶切下，利用透析袋法进行回收后，电泳确保质粒全部为超螺旋状态，测定其浓度及纯度， IE缓冲液稀释为0.05g/ml，保存于-20。1.2.3 大肠杆菌感受态细胞制备及转化37下250 rmin培养过夜的大肠杆菌培养物，按1：40接种于l5 ml LB培养基的摇菌试管中，继续振荡扩大培养根据生长曲线，每隔一定时间取一支菌液，测定OD600后,1.5ml转入l0 ml无菌离心管，冰浴中冷却10 min，4 ，40OO rmin离心10 min，弃上清，用12体积的预冷0.1 molL CaCl2，溶液悬浮细胞，冰浴中放置30 min，4，4OOO rmin离心10 min根据OD600一活菌细胞浓度图，加入一定体积的0.1molL CaCl2溶液，调整细胞浓度为2.5109细胞ml，取200l感受态细胞，分装到1.5ml无菌离心管，4保存过夜加入0.1g质粒DN，冰浴30 min后42热休克6090s，冰浴中迅速冷却23 min，加入0.8 mlLB培养基，37低速振荡培养1 h，室温，40OO rmin离心5 min，吸去0.9 ml培养基，混匀剩余培养物，全部涂布在加有X-gal，IPTG及氨苄青霉素的LB平板培养基上，37正向培养1小时后，倒置培养l216 h，每个时相涂布9个平板并以未加质粒DN的转化液作对照。2 结果与分析2.1 Ecoil DH5的生长曲线在菌株与菌株之间，O 值与每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测定特定Ecoli的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600，从010 h，测定细菌不同生长时期的OD600，绘制生长曲线为保证细菌培养物的生长密度不至过高，应每隔l520 min检测OD600(表1)。得到Ecoli DH5的生长曲线(见图1)，以便预测培养物的OD600达到0.4的培养时间。如图1所示，该生长曲线主要包括了E.coli DH5在37培养条件下群体生长周期中的迟缓期、对数期及稳定期初期。表1 Ecoli DH5的生长曲线序号 时间（min） OD600 序号 时间（min） OD6001 0 0.052 11 200 0.6202 20 0.069 12 220 0.7203 40 0.094 13 240 0.8374 60 0.110 14 260 0.9065 80 0.171 15 280 0.9576 100 0.189 16 300 1.0187 120 0.246 17 320 1.0978 140 0.337 18 340 1.1019 160 0.411 19 360 1.14210 180 0.5212.2 E.coli DH5的OD600一活菌细胞浓度图将10-4，10-5，10-6 稀释度的培养物铺于无抗生素的LB平板培养基上以计算每一时相的活细胞数，选取一组数据(见表2)经线性化处理得E.coli DH5的OD600一活菌细胞浓度图(图2)，使分光光度计读数得到标准化。由图2可看出细菌细胞浓度与菌液光密度值成正比。表2 E.coil DH5的OD600一活菌细胞浓度序号 OD600 菌落数/109个 序号 OD600 菌落数/109个 1 0.171 2.8 5 0.411 8.952 0.189 2.2 6 0.521 13.023 0.264 6.19 7 0.620 17.094 0.337 6.20 2.3 不同生长时期的Eeoli DH5菌株转化率的测定细菌在不同生长时期的活细胞浓度不同。要进行不同生长时期转化率的比较，必须调整细胞密度至相同情况。为达到高效转化，活细胞数务必少于108细胞m1。根据CaC12法，第二次CaC12处理时，活细胞浓度浓缩至2.5109细胞ml，转化菌平板培养后计数，并求出转化率(每微克DN转化后所产生的单菌落个数，菌落数gDN)，见表3。结果如图3所示，发现感受态细胞的转化率与OD600 值显著相关。Eeoli DH5菌株在OD600 值为0.400.42时获得最高转化率。表3 不同生长时期的Ecoil DH5菌株转化率序号 OD600 转化率 序号 OD600 转化率1 0.244 5920 6 0.408 180002 0.277 11280 7 0.419 246403 0.292 11200 8 0.521 159204 0.332 11520 9 0.559 128005 0.358 17920图3 Ecoil DH5不同生长时期的转化率3 结论大肠杆菌群体生长周期包括迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。结合所绘制的生长曲线可知：当OD600值为0.40一0.42时，细菌正处在对数期的中期，此时，细菌处于最理想的生长状态。细菌在该期生命力强，对转化缓冲液的反应性强，被诱导处于感受态的细菌较多。同时我们还应注意到，当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降，所以DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。参考文献：1J萨姆布鲁克，DW拉塞尔分子克隆实验指南M黄培堂，译第3版北京：科学出版社，2002:8796.2李路怡，易建华大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨J生命科学研究，1998，2(3)：44503卢圣栋现代分子生物学实验技术M北京：高等教育出版社，19954 徐英黔, 吴 蕾, 甘一如. CTAB法制备超螺旋质粒DNA, 过程工程学报,2007,7(02):390-393.The improve of transformation of competent cells from E.oil DH5bstract：Experimental material against Ecoli DH5，take on the particular strain in diferent growth stages of the conversion efficiency of the method to explore and to establish a high conversion rate of competent cells of the experimental programmeThe experimental results show that the growth of the bacteria in th