RSAP标记技术在花生遗传多样性检测中的初步应用.doc

目录 摘要 1 Abstract 1 1 引言 2 1 1 RSAP 标记技术 2 1 2 DNA 提取方法 2 1 3 PCR 反应原理及成分 3 2 材料与方法 4 2 1 材料 4 2 1 1 32 个花生品种 4 2 1 2 主要试剂 5 2 1 3 主要仪器用具 5 2 2 方法 5 2 2 1 花生 DNA 的提取 5 2 2 2 PCR 反应体系的优化 6 2 2 3 PCR 反应条件中退火温度的确定 6 2 2 4 引物初步筛选 7 2 2 5 多样性检测 7 3 结果及分析8 3 1 PCR 反应体系的优化 8 3 1 1 引物浓度对扩增结果的影响 8 3 1 2 模板浓度对扩增结果的影响 8 3 1 3 TaqDNA 聚合酶浓度对扩增结果的影响 9 3 1 4 dNTPS浓度对扩增结果的影响 9 3 2 退火温度对扩增结果的影响 10 3 3 引物筛选结果 11 3 4 多样性初步分析 11 4 讨论 12 4 1 RSAP 特点 12 4 2 影响 RSAP 因素 13 致谢 14 参考文献 15 1 RSAP 标记技术在花生遗传多样性检测中的初步应用 摘要 限制性位点扩增多态性 restriction site amplification polymorphism RSAP 是根据基因组内普遍存在的酶切位点来设计特殊的引物 通过简单的梯度PCR反应来产生多 态性 本研究首次建立了适合于花生RSAP分析的PCR反应体系和反应条件 并对RSAP标记技 术在花生遗传多样性检测中的应用进行了初步研究 利用所建立的体系 使用15对引物对 32个花生DNA进行了PCR扩增 经过重复验证 有8对引物能够扩增出清晰且稳定的条带 这些 条带具有一定的多态性 说明所建立的体系可用于花生遗传多样性分析 关键词 RSAP 花生 遗传多样性 The Application of RSAP Marker Technique in Diversity Detection of peanut Student majoring in biotechnology Li Pengfei Tutor Qiao Lixian Abstract Restriction site amplified polymorphism RSAP requires just a simple polymerase chain reaction PCR to generate polymorphic markers around restrictive site An RSAP analytic system suit for peanut was set up and applied in diversity detection of peanut for the fist time In this experiment fifteen primer pairs were screened with 32 peanut varies by the RSAP analytic system and eight of them produced stable and reproducible amplification patterns Some of the fragments screened by the primer pairs were polymorphic indicting that the analytic system was suit for the diversity detection of peanut Key words RSAP peanut diversity 2 1 引言 花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一 营养价值高 用途广 深 受人们喜爱 中国花生世界年产量居世界第一位 万书波 2003 随着中国加 入世贸组织和现代交流的国际化 选育更加高产 高油 抗逆性强 早熟或其 他专用型花生品种变得尤为重要 王传堂 1999 传统的育种方式存在周期性 长 对隐性基因控制的性状不易筛选等局限性 而我国对花生在分子生物学方 面的研究还相对落后于其他作物 孙大容 1998 因此 探索花生基因组研究 方法对于花生遗传育种研究和加速野生种的利用有其重要意义 RSAP作为一种 新型的分子标记技术 简便且具有潜力 1 1 RSAP标记技术 RSAP restriction site amplification polymorphism 即限制性位点扩 增多态性 是通过简单的梯度PCR 反应 针对基因组内普遍存在的酶切位点来产 生多态性标记 RSAP的引物是依据SRAP sequence related amplified polymorphism 序列相关扩增多态性 的引物设计原理建立 Li G et al 2001 使用1对17 18个碱基组成的引物序列 5 端前12 14个碱基为没有特 殊组成的填充序列 3 端的选择性碱基为4 6个碱基组成的限制性内切酶的酶 切位点序列 依据引物内 3端选择性碱基 即基因组内限制性内切酶位点的不同 而产生多态性 该技术无需限制性酶切及其它复杂步骤 仅1个简单的PCR 反应 即可实现对DNA限制性位点的多态性进行检测 因此它是RFLP技术的1种简化 该 技术由杜晓华等首先在辣椒中建立 杜晓华等 2006 同时在苦瓜和水稻上作 了验证 乔利仙 2007 对紫菜遗传多样性进行了多态性分析 除此之外没有 其它报道 本研究首次将新型分子标记技术RSAP的PCR体系在花生分析上进行了 优化 并对32个花生的遗传多样性进行了初步检测 1 2 DNA提取方法 生物体基因组DNA的提取是进行核酸分子生物学研究的基础 对大部分细菌 来说 主要细胞提取物就是DNA RNA和蛋白质 因此苯酚提取或蛋白酶降解后 接下来利用核糖核酸酶来分解RNA就可得到较为纯净的DNA样品 植物全基因组 的提取有一定的困难性 主要在于植物组织较难处理 它存在细胞壁 组织中 含有大量的碳水混合物 这些碳水混合物不能通过苯酚提取而除去 为此我们 可以加入某种去垢剂 CTAB 使其与核酸一起形成不溶的混合物 植物总 DNA 的提取方法主要有 CTAB 法和 SDS 法 针对不同植物总DNA的提取流程是不同的 3 即便是同一植物提取总 DNA 的方法相同 其技术流程也存在很大差异 Shokes FM 1987 Bateman D F 1964 改进方法的聚焦点是提高 DNA 的质量 而 一味追求提高 DNA 质量 增加了许多操作环节 所以在满足试验需求的前提下 应考虑简捷可靠的 DNA 提取技术流程 本实验所用的模板 DNA 就是用经过改 进的 CTAB 法 陈静等 2008 提取并初步纯化的 1 3 PCR 反应原理及成分 本实验的核心技术和基础步骤是PCR 多聚酶链式反应 Polymerase Chain Reaction PCR 是美国Perkin Elmer Cetus公司人类遗传研究室Mullis K B 等人于1985年发明的一种快速体外DNA片段扩增技术 是八十年代分子生 物学资源领域的一项革命性突破 被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程 碑 该技术一问世 就在分子生物学 医学 生物工程 法医学 考古学等领 域得到快速而广泛的应用 并且对已建立的基因克隆 DNA序列分析等现代分子 生物学技术的发展也起了巨大的推动作用 PCR技术是一种模拟自然DNA复制过 程的体外酶促合成特异性核酸片段技术 亦称无细胞分子克隆技术 它以待 扩增的两条DNA链为模板 由一对人工合成的寡核苷酸作为介导 通过DNA聚合 酶促反应 在体外进行特异DNA序列扩增 其过程包括模板变性 denature 引物退火 annealing 和用DNA聚合酶延伸 longation 退火引物在内的重复 循环系列 使末端被引物5 端限定的特异性片段成指数形式累积 由于在每一 循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板 因而每次循环中靶 DNA 的拷贝数几乎呈几何级数增长 因此20次PCR循环将产生约一百万倍的扩增产物 具有操作简单 快速 灵敏度高 特异性强的特点 并且具有从 DNA 粗制品和 降解的 DNA 模板中扩增靶序列的能力 PCR的原理类似于DNA的天然复制过程 关键是运用两个起始引物 分别与 待扩增序列相对的两条单链 DNA 结合 结合位点分别位于待扩增序列的两端 并且 3 端相对 然后利用DNA聚合酶依赖于 DNA 模板的特性 模仿体内的复 制 在两个引物之间诱发聚合酶反应 在该反应体系中 各组分用量的大小对 扩增是否成功会有极大影响 因此一个反应体系是否适合于对某种作物进行基 因扩增 需要进行优化验证 PCR反应中的主要成份有 1 引物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定 引物的好坏和 用量往往是PCR成败的关键 一般引物长度约为16 30bp 太短会降低退火温度 影响引物与模板配对 从而使非特异性增大 太长则比较浪费 且难以合成 4 引物不能与模板结合位点以外的序列互补 所扩增产物本身无稳定的二级结构 以免产生非特异性扩增 影响产量 一般PCR反应中的引物终浓度为0 2 1 0 mol L 引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体 过低则降低产量 2 4种三磷酸脱氧核苷酸 dNTPs 一般反应中每种dNTPs的终浓度为20 200 mol L 理论上4种dNTPs 20 mol L 足以在100 l反应中合成2 6 g的 DNA 当dNTPs终浓度大于50mmol L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性 4种dNTPs的 浓度应该相等 以减少合成中由于某种dNTPs的不足出现的错误掺入 3 Mg2 Mg2 浓度对 TaqDNA聚合酶影响很大 它可影响酶的活性和真 实性 影响退火和解链温度 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等 通 常Mg2 浓度范围为0 5 2mmol L 对于一种新的PCR反应 可以用0 1 5mmol L的 递增浓度的Mg2 进行预备实验 选出最适的Mg2 浓度 在PCR反应混合物中 应 尽量减少高浓度的带负电荷的基团 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2 浓度的 物质 以保证最适Mg2 浓度 4 模板 PCR反应必须以DNA为模板进行扩增 模板DNA可以是单链分子 也可以是双链分子 可以是线状分子 也可以是环状分子 线状分子比环状分子 的扩增效果稍好 就模板DNA而言 影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度 扩增多拷贝序列时 用量更少 模板量过多则可能增加非特异性产物 DNA中的 杂质也会影响PCR的效率 5 Taq DNA聚合酶 一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92 5 130min 95 40min 97 5min 现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶 这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间 Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是 它的出错率 在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意 在100 LPCR反应中 1 5 2U的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环 所用的酶量可根据 DNA 引物及 其它因素的变化进行适当的增减 酶量过多会使产物非特异性增加 过少则使 产量降低 2 材料与方法 2 2 1 材料 2 1 1 32 个花生品种 白皮 2 新泰四因子 野杂一号 兰娜 西洋生 紫 Krapts 黑皮 920 白沙 13 白沙 131 17 白沙 261 3 白沙 1016 四粒红 8823 HH2 W 花 17 花 37 丰华 3 花育 20 花育 23 鲁花 7 鲁花 8 鲁 5 花 9 鲁花 12 潍花 8 伏旱 1 伏旱 2 青岛 9616 刑 8715 徐州 68 4 杂 选 4 丰华 3 号 2 1 2 主要试剂 EB 溴酚蓝 琼脂糖 氯仿 异丙醇 异戊醇 无水乙醇 ddH2O dNTPs Taq 酶 10 Buffer 6 lodding Buffer CTAB 20 TBE 20 过硫酸铵 75 乙醇 亲和硅烷 TaqE dNTPs 50 TAE 配方 Tris 242g Na2EDTA 2H2O 醋酸 57 1ml 加 ddH2O 定容至 1L 20 TBE 配方 Tris 216g 硼酸 110g Na2EDTA 2H2O 14 88g 加 ddH2O 定容 至 1L 40 丙烯酰胺 丙烯酰胺 380g N N 亚甲叉丙烯酰胺 20g 加 ddH2O 至 600ml 将溶液加热至 37 使试剂溶解 用蒸馏水将体积调至 1L 用硝酸纤维素滤膜过 滤溶液 室温保存于棕色瓶中 6 丙烯酰胺 尿素 450g 40 丙烯酰胺 150ml 10 TBE100ml 加 ddH2O 至 1L 亲和硅烷 无水乙醇 99ml 冰乙酸 500 L binding 原液 500 L 硝酸银染色液 1 5g 硝酸银溶于 1LddH2O 水中 显色液 NaOH 20g Na2CO3 0 4g 甲醛 4ml 加 ddH2O 至 1000ml 甲酰胺染料 去离子甲酰胺 98 EDTA 10mM 溴酚蓝 0 025 二甲苯青 0 025 2 1 3 主要仪器用具 琼脂糖电泳设备 聚丙烯酰胺电泳设备 水浴锅 离心机 灭菌锅 移 液枪 枪头 离心管 试管 EP 管 烧杯 玻璃棒 紫外灯 培养瓶 酒精灯 一次手套 PCR 仪 Takara TP600 2 22 2 方法 2 2 1 花生 DNA 的提取 取花生叶片 0 2 0 3g 于 1 5ml 离心管中 加液氮研磨充分 加入 500ul65 预热的 CTAB 混匀后 65 水浴 30min 取出放置冰上冷却后 加入 500 L 氯仿 异戊醇 24 1 冰上放置 10 30min 12000rpm 离心 10min 取上清液于另一试管中 加入等体积的苯酚 氯仿 1 1 抽提液 充分混匀冰上放置 1min 12000rpm10min 6 取上清液于另一试管中 加入等体积 20 冷却的异丙醇 颠倒混匀 20 放置 1h 12000rpm 离心 10min 弃上清 70 乙醇洗涤过夜 10000rpm 离心 5min 吸干后吹干 加入 20 30 L TE 溶解 1 琼脂糖凝胶电泳检测 2 2 2 PCR 反应体系的优化 为确定适宜的PCR 扩增体系 本研究以RSAP适用于辣椒的 PCR 反应体系 杜晓华等 2006 以及花生的序列相关扩增多态性 SRAP 扩增体系 张建 诚等 2005 为基础 初步采用下述体系扩增 并逐步对引物浓度 模板浓度 聚合酶浓度及dNTPs浓度进行优化 表1初始扩增体系 试剂使用浓度终浓度 ddH2O 10 buffer20mM Mg2 2mM dNTPs2 5mM0 2mM Primer1 210uM650nM TaqE5U uL1U template60ng30ng 在上表终浓度基础上进行浓度梯度试验 1 引物浓度 终浓度分别为500 550 600 650 700 nM 2 模板浓度 终浓度分别为60 50 40 30 20 10 5 ng 3 聚合酶浓度 终浓度分别为0 75 1 1 25 1 5 1 75U 4 dNTPs浓度 终浓度分别为0 2 0 25 0 3 0 35 mM 2 2 3 PCR 反应条件中退火温度的确定 退火温度的确定借鉴限制性位点扩增多态性 Restriction site amplified polymorphism RSAP 适用于紫菜的PCR程序 乔利仙 2007 具 体如下 94 变性5 m in 94 1 m in 35 1 m in 72 1 m in 5 个循环 94 1m in 46 1m in 72 1min 35 个循环 72 10 m in 4 保存 为确定最佳退火温度 在第二轮扩增中 试验将后35 个循环的退火 7 温度分别设为46 47 48 49 50 进行PCR 扩增 8 2 2 4 引物初步筛选 表 2 RSAP 分析所用的引物 引物 Primers 序列 Sequence 5 to 3 限制酶切位点 Restriction site 限制酶 R1ATTACAACGAGTGGATCCGGATCCBam H R2GACTGCGTACATGAATTCGAATTCEco R R3TATCTGGTGAGGGATATCGATATCEco R R4TTGGGATATCGGAAGCTTAAGCTTHin d R5ATAGTCCTGAGCGGTTAATTAAMse R6ATTGGACTGGTCTCTAGATCTAGAXba 本试验选取了 6 个引物 各引物可随机组合共得到 21 个引物组合 对这 21 对引物进行了初步筛选 步骤如下 1 运用上述实验所建立的反应条件和PCR反应体系 用21对引物进行扩增 2 2 琼脂糖凝胶电泳检测 电极缓冲液采用1 TAE 稳压100V 30min 溴 化乙锭染色 2 2 5 多样性检测 用所筛选的引物对32个花生DNA进行PCR扩增 检测这些品种间的遗传多样 性 扩增产物用6 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 凝胶制备电泳步骤 萨姆布鲁克 2002 1 玻璃板用自来水 洗涤剂冲洗后再用75 无水乙醇淋洗 电扇吹干后 涂上亲和硅烷 风扇吹干 2 有机玻璃板用自来水冲洗 无水乙醇淋洗 电扇吹干 涂上剥离硅烷 电扇吹干 3 用支架将两块玻璃板固定 底板用透明胶封住 留下灌胶孔 灌胶孔 用白胶布粘住备用 4 取80mL 6 丙烯酰胺 加240 L 20 过硫酸铵 再加80 LTEMED 混匀 后吸入注射器 注射器气泡赶出后将凝胶注入胶板 5 插上梳子 放置1 2小时完成聚合 6 底板去掉后 把凝胶板放入电泳槽中 去掉梳子 加入1 TBE 使缓冲 液覆盖样品孔 接通电源预电泳30min 60W 1300V 9 7 PCR样品处理 样品中加入等体积或一半体积的loading buffer 94 变 性5min后开盖置于冰上 8 暂停电泳 每孔上样5 L 9 电泳90min后硝酸银染液染色15至30min 蒸馏水冲洗数次后 显色液显 色15至30min 10 自来水冲洗 晾干 照相 3 结果及分析 3 1 PCR 反应体系的优化 3 1 1 引物浓度对扩增结果的影响 引物用量少 与模板DNA结合效率低 产物的产量就会受到影响 引物用量 过大 也有不利影响 第一 会增加非特异性结合的机率 第二 也会增加引 物之间形成引物二聚体的概率 第三 引物也可以和TaqDNA聚合酶竞争结合 Mg2 引物浓度的变化必然会影响引物与模板DNA结合的机会 从而影响扩增效 率 本实验结果表明 宜采用600nM 1 2 3 4 5 图1 引物浓度对扩增结果的影响 1 5引物浓度依次为 500 550 600 650 700 nM 3 1 2 模板浓度对扩增结果的影响 模板量为20 60ng 在中均能获得扩增得到目的条带 且电泳带型基本一致 说明RSAP技术对模板DNA 量的要求范围较宽 同时也发现 模板量为10ng左右 时条带已较淡 表明模板浓度过低 10ng 不太适宜 过低使起始拷贝数少 影响扩增产物量 过高则可能因蛋白或其他杂质会妨碍扩增 导致产物量减少 推荐在花生RSAP分析中使用30 40ng 10 1 2 3 4 5 6 7 图2 模板浓度对扩增结果的影响 1 7模板浓度依次为 60 50 40 30 20 10 5 ng 3 1 3 TaqDNA 聚合酶浓度对扩增结果的影响 TaqDNA聚合酶的用量过大会造成浪费 并且会导致非特异性扩增 用量小 会影响扩增效率 降低扩增产物的产量 Fang X J 2001 TaqDNA聚合酶的用 量会受到反应体系体积 酶活性及酶耐热性等因素的制约 该结果表明 终浓 度1 25U为佳 1 2 3 4 5 图3 TaqDNA聚合酶浓度对扩增结果的影响 1 5 TaqDNA聚合酶浓度依次为 0 75 1 1 25 1 5 1 75U 3 1 4 dNTPs 浓度对扩增结果的影响 dNTPs 为 PCR 反应提供底物 使得产物得以延伸 因此 dNTPs 用量过低 就会影响 PCR 效率 甚至使 dNTPs 耗尽 导致产物单链化 影响产物产量 另 一方面 dNTPs 用量过高 会导致 TaqDNA 聚合酶的错误掺入 影响扩增的准确 性 另外 dNTPs 可以 1 1 的结合 Mg2 其用量细微的变化 就会显著的降低 11 Mg2 浓度 从而会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性 影响 PCR 效率 甚至会阻止反 应进行 该结果表明 适宜选用的 dNTPs 浓度为 0 2mM 1 2 3 4 图4 dNTPs浓度对扩增结果的影响 1 4 dNTPs浓度依次为 0 2 0 25 0 3 0 35 mM 3 2 退火温度对扩增结果的影响 反应程序方面 退火温度对扩增结果的影响较大 退火温度过低会造成引 物和模板DNA之间的错配 产生非特异性产物 退火温度提高会提高产物的特异 性 但过高会阻碍引物和模板DNA之间的配对 减少产物的产量 甚至无产物 所以此项验证表明47 为佳 1 2 3 4 5 图5 退火温度对扩增结果的影响 1 5退火温度依次为 46 47 48 49 50 12 3 3 引物筛选结果 用建立起来的反应体系和反应条件 对 21 种引物组合进行扩增 表明有的 引物不能扩增出清晰条带 这可能与花生基因组中限制性酶切位点的位置有关 其中有 8 对引物有明显的条带 有一定多态性 这 8 对引物分别为 R1 R3 R2 R3 R2 R5 R3 R4 R3 R6 R4 R5 R4 R6 R5 R6 图6 引物筛选结果 图中 1 2为引物R1 R3 3 4为引物R1 R5 5 6为引物R1 R6 3 4 多样性初步分析 初始扩增体系的扩增条带不太清晰 优化后的体系明显好于初始体系 用 优化后体系对 32 个花生品种进行 PCR 扩增 得到 10 余条扩增产物 而且扩增 产物显示了一定的多态性 扩增效果较好 说明该体系可以用于花生遗传多样 性分析 13 1 10 20 30 图7 初始扩增体系的扩增结果 图8 优化后扩增体系的扩增结果 4 讨论 4 1 RSAP 特点 RSAP参照了SRAP 分析的原理和方法 设计了独特的引物和专一的梯度 PCR 14 扩增程序 无需限制性酶切及其它复杂步骤 仅一个简单PCR 反应即可实现对 DNA 限制性位点多态性进行检测 与SRAP 分析相似 RSAP 前5个循环采用较低 的退火温度 35 以保证引物通过部分匹配与模板相结合 提高扩增的效率 后30 个循环采用较严谨的退火温度 47 对已扩增片段进行特异性扩增 以 保证扩增产物的稳定 引物的设计借鉴了RAPD 随机序列的模糊匹配原理 形成 了以酶切位点为核心的序列 结合5 端随机序列的部分错配引物结构 从而实现 了对限制性位点的选择性扩增 引物长度设计为17 18 bp 保证了扩增结果的 稳定可靠 从操作步骤上讲 RSAP 技术是 AFLP 的极大简化 从基因组的扩增 区域上讲 RSAP 是对SRAP 标记的有效补充 因为SRAP 主要针对单拷贝区扩增 而RSAP 扩增的限制性位点则散布于整个基因组区 RSAP 引物可两两随机配对 产生较多对引物 降低了引物的合成成本 加上步骤简单和检测位点较多 RSAP 技术具有一定的成本优势 4 2 影响 RSAP 因素 RSAP是一种新型分子标记 其反应条件受到多种客观因素影响 而且在不同的物种中有 较大差异 所以直接借鉴别人所用的反应体系极少能得到好的扩增效果 同时它又是一种 操作简单 产率中等 稳定可靠的DNA 标记技术 该实验表明对花生来说其适宜的退火 温度为47 温度太高不易产生扩增条带 温度太低则易产生非特异性条带 在15ul PCR 反应体系中 模板DNA浓度为30 40ng 栽培种 较为适宜 除了对材料中的32品种进行模板 浓度分析外 该试验也对部分野生种 DNA 进行扩增 对于野生种来说 因为其作为模板 的 DNA 是用种子提取 可能含有大量妨碍扩增的脂肪等杂质 所以常规浓度的模板样品 可能因限制性位点被包被而无法扩增出条带 该试验野生种能扩增出条带的模板浓度仅为 5 15ng 因该实验借鉴的基础体系中缓冲液对扩增无明显影响 所以Mg2 buffer 浓度依 然采用2 mmol L dNTPs 浓度为0 2mmol L Taq DNA 聚合酶量为1 25 U 2 条引物均为 600 nmol L 扩增程序中除去退火温度对扩增效果影响较大外 循环数也很重要 但该实 验初始采用的循环数为35 理论上不会有问题故未进行梯度改变 另外操作的规范性 仪 器的性能 试剂的质量等均会造成结果偏差 该研究表明RSA