鹿茸、鹿心和鹿血中IGF-Ⅰ的含量检测.docx

鹿茸、鹿心和鹿血中胰岛素样生长因子的含量检测陈凡波，尹建元，刘竞妍，杨玉霞，孙丹丹，刘继华*（吉林大学药学院，吉林长春130021）摘要：目的 对鹿茸、鹿心和鹿血中胰岛素样生长因子（IGF-）的含量进行检测和分析比较。方法 采用氨-醋酸铵缓冲液超声提取鹿茸、鹿心和鹿血中的IGF-，并利用超滤法和固相萃取法对IGF-提取液进行浓缩与分离纯化，以放射免疫法（RIA）测定鹿不同组织部位中IGF-的含量。结果 鹿茸、鹿心和鹿血中IGF-含量差异较大，鹿茸粉中为61.9ng/g，鹿血中的浓度为21.9ng/mL，鹿心中未检出。结论 鹿茸中IGF-的含量明显高于鹿血和鹿心，是提取鹿茸IGF-的最佳组织部位。关键词：胰岛素样生长因子-1（IGF-）；放射免疫法(RIA)；超滤法；固相萃取法作者简介：陈凡波（1989-），男（汉族），四川广元人，现为吉林大学药学院在读硕士研究生，学士学位，主要从事天然产物研究工作。*通讯作者简介：刘继华（1972-），女（汉族），吉林长春人，现任吉林大学药学院副教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事天然产物化学和药代动力学研究工作。鹿科动物梅花鹿（Cervus Nippon Temminck）和马鹿(Cervuselaphus Linnaeus)药食兼用，药用部位为鹿茸、鹿血和鹿心等，均为我国传统名贵中药与滋补品。鹿茸系梅花鹿或马鹿的雄鹿尚未骨化的幼角，主治阳痿滑精、宫冷不孕1等症；鹿心具有改善心脑血管和神经系统的功能2；鹿血在心悸、风湿及抗衰老3等方面有较好疗效。鹿产品含多种生长因子4，其中胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor-1, IGF-）为一种极为重要的活性成分，其水平紊乱与肝损伤5、胰岛素抵抗和骨骼发育不良6等疾病密切相关，近年来受到广泛关注710，目前已用于治疗骨质疏松症11,12，具有较大的临床应用价值。郝林琳13等对马鹿茸不同部位IGF-含量进行比较分析，得出IGF-在鹿茸尖部含量最高（27.6ng/g）的结论，但目前国内外尚无针对鹿不同组织部位IGF-含量比较的报道。因此本实验采用超声法提取IGF-，利用超滤浓缩和固相萃取技术对其进行浓缩和纯化，采用放射免疫法（RIA）测定了梅花鹿不同组织部位提取物中IGF-的含量。本实验成果可为梅花鹿产品中IGF-的开发利用提供理论和实践依据，并为梅花鹿产品质量标准的完善提供新的思路。1材料与仪器本实验中采用的鹿不同组织部位均来源于梅花鹿。鹿茸粉购自吉林森宝堂参茸制品有限公司；鹿心和鹿血样品由吉林睿康生物技术有限公司提供；IGF-放免试剂盒，购于天津九鼎医学生物工程有限公司；实验用水为双蒸水，试剂均为分析纯。GC-2016放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司)；TGL-20M台式高速冷冻离心机(湖南省凯达实业发展有限公司)；DFNC-102氮吹仪氮气发生器(杭州德克尔实验设备有限公司)；MD-200-2氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)；BT125D电子分析天平(德国赛多利斯股份公司)；HQ-250D数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Millipore超滤管（4mL,10kDa）；Supelco固相萃取柱(500mg, 5ml)。2方法与结果2.1样品溶液的制备2.1.1鹿茸和鹿心样品溶液的制备 取鹿茸粉、鹿心粉末各3g，精密称定，分别置于100mL锥形瓶中，分别加入pH10的氨-醋酸铵缓冲液（4mol/L）20mL，超声提取20min，并于-4离心10min（8000 rpm），吸取上清液，剩余药渣照上述步骤重复提取一次，合并两次所得提取液，超滤浓缩至2ml，取浓缩液进行固相萃取，上样后以30%甲醇/水溶液洗脱，收集洗脱液，于N2下吹干，残渣分别精密加入蒸馏水1mL溶解，即得鹿茸粉和鹿心粉的样品溶液。2.1.2鹿血样品溶液的制备 精密吸取鹿血3mL置于离心管中，按1：1比例精密加入无水乙醇3ml，混匀，静置沉淀，于-4下离心10min (8000rpm)，吸取上清液，于N2下吹干，残渣精密加入蒸馏水500L溶解，即得鹿血样品溶液。2.2对照品溶液的制备 取IGF-标准品适量，精密称定，分别加标准品稀释液溶解，混匀，制成浓度分别为10，25，50，100，250，500ng/mL的标准品溶液。2.3 IGF-测定方法采用放免法检测，试剂加入程序和操作方法如表1所示。表1 IGF- 放免法检测加液程序TNSBB0S1-S6样品蒸馏水100标准稀释液100100标准品100样品100抗体100100100125I-IGF-100100100100100充分混匀，4放置24h分离剂500500500500500混匀，室温放置30min，43600rpm离心20min，吸弃上清液，测各管沉淀cpm数检测结果按照下面的公式计算出样品的(B/B0)值，然后带入标准工作曲线得到样品中IGF-的浓度。计算公式 (B/B0)（标准或样品管的cpm数NSB管的cpm数）（B0管的cpm数NSB管的cpm数）1002.4方法学考察2.4.1线性关系考察 精密吸取IGF-标准品溶液10，25，50，100，250，500ng/mL各100L，按“2.3”项下方法检测，以lg(B/B0)%为纵坐标，标准品浓度（ng/mL）为横坐标，得线性回归方程：y = -0.0035x + 1.8512，r= 0.9993，线性范围为10500ng/mL。2.4.2精密度实验 精密吸取IGF-标准品溶液（60ng/mL）100L，按“2.3”项下方法检测，连续测样6次，测得IGF-含量的RSD值为3.2%（n=6），表明仪器具有良好的精密度。结果见表2。表2精密度实验结果浓度/ng.mL-1平均值/ng.mL-1RSD(%)12345657.359.661.261.857.458.659.33.22.4.3重现性实验 取同一批次鹿茸样品共6份，每份3g，按“2.1.1”项下方法制备样品供试品溶液，分别精密吸取100L，按“2.3”项下方法检测。结果鹿茸样品中IGF-含量的平均值为61.8 ng/g，RSD为3.8%（n=6），表明方法的重现性好。结果见表3。表3重现性实验结果含量/ng.g-1平均值/ ng.g-1RSD(%)12345661.361.459.963.559.165.461.83.82.4.4加样回收率实验 取同一批次已知IGF-含量的鹿茸样品，精密称定3g，按“2.1.1”项下方法制备后，精密吸取IGF-提取液50L，共吸取6份，再分别准确加入50L的IGF-标准品溶液（500ng/ml），按“2.3”项下方法检测，并计算回收率。结果见表4。表4加样回收率实验结果编号原有量/ng加入量/ng测得量/ng回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)16.22531.5101.298.13.526.22530.296.036.22530.095.246.22530.296.056.22530.396.466.22532.1103.62.5鹿茸、鹿心和鹿血中IGF-含量测定分别取鹿茸、鹿心和鹿血，按“2.1”下方法制备，按“2.3”项下方法检测，计算含量，结果见表5。表5鹿茸、鹿心和鹿血中IGF-含量测定结果部位含量/ ng.g-1、ng.mL-1平均含量123鹿茸61.064.160.661.91.9ng.g-1鹿心鹿血22.122.521.121.90.7ng.mL-13讨论IGF-是鹿茸中的重要活性成分之一，研究发现IGF-具有促进糖尿病患者足溃疡伤口愈合14，以及阻碍早产儿视网膜病变发生15等多种药理活性，临床上具有较大开发利用价值。为比较不同鹿组织中IGF-的含量，明确IGF-富集的鹿组织部位，本文首次对鹿茸、鹿心和鹿血中IGF-的含量进行了检测。在鹿组织样品的处理方法上，参考文献16选择碱性氨-醋酸铵缓冲液超声提取IGF-，之后以超滤法浓缩所得提取液。为了进一步提高样品中IGF-的浓度和纯度，提高检测灵敏度，本文进一步增加固相萃取技术处理样品溶液，结果表明，经过固相萃取后的样品在放免法检测时杂质干扰少，重现性和准确度更好。本实验研究结果表明，鹿茸，鹿心和鹿血中IGF-含量差异较大，其中以鹿茸中含量最高(61.9ng/g)，鹿血次之（21.9ng/mL），鹿心中未检出，说明IGF-在鹿组织中的主要富集部位是鹿茸部位，若想从鹿组织中提取IGF-，鹿茸是最佳提取部位。另一方面，鹿血中的IGF-虽然较鹿茸少，为鹿茸中含量的35%左右，但是鹿血量多，再生快，也不失为好的、可持续性强的鹿IGF-的提取资源。目前国内市场上鹿保健品及其药品较多，多为原药材的粗提物，质量参差不齐，而不同厂家鹿产品质量差异较大的原因可能在于其有效成分IGF-含量差异大。因此，可将IGF-含量作为衡量鹿保健品及其药品的质量新标准之一，以保证用药的有效性, 这将促进鹿产品的精加工，从而提高其产品附加值与产业价值。参考文献：1国家药典委员会.中国药典,一部S.北京:化学工业出版社,2010.2徐成勇,郭本恒,吴昊,等.酸奶发酵剂和乳酸菌生物技术育种J.中国生物工程杂志,2004,(7) :55.3王守本,孙德水,周淑荣.鹿血与鹿茸血的研究利用概况J.特产研究, 1999,(4) :51.4王秋玉, 王本祥.论鹿茸生长因子J.中医药学报,2000,(6) :10.5Aksu I, Baykara B, Kiray M, et al. 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