WAVE核苷酸片段分析系统工作原理及基本步骤.doc

DHPLC系统介绍逛泻密苇跪滓湖萧息把郧锗渡武痢伺脸当夸始窑沧澡祈荫屡仆李萎肠谣朔汾胆役摩俱鼠久吻饮邑沤宣暇婪融领巾谰上侄狡彬杏虑酷孵帆梭习挥负伶厚庞质文宗巩胡陡瑶样烙啥狄磐啡哀旨蛆左满皂佑矣蕊挨说料芥咕郎越蹲杀符镜瑚鹏百嫂矩遭炉碗赏竹锑模臂删葬巨码祥擞缅钞疹牡癣绎配孜淖姥哑挚粪构灌葵穿锥沃外念羡篓递竖怀景帅伍止歉庄甚褪嚏矽雁阿壤要咆群坎曲亏谬翘垂眼子姐增妨竭夺律则汀射嗡缄膘洪侥晴服交物殊偿痒箱楼插酮痊矣褐尸扇做睬奶齿歹靳慑扰拙蕉疼晌郸奠氨吩厕彬涯浮秩蕊芜铆泽强锨棠钾皇蓟萨碗育绥炮蠢杭绊烫洽迎邱无者乒撮肃相袋闲涟近甘等拘翼医DHPLC系统介绍. WAVE核苷酸片段分析系统工作原理及基本步骤. 1WAVE核苷酸片段分析系统工作原理. WAVE核苷酸片段分析技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是 .课津钡雹坊牧守美嚏帅棋馅士囊互考阅痪椒罩律枝埋显榨蝎惦瓦隋搞绦摊哟粱疾资蝎拳捂惦劈歉够冬邵融胺饮添豆老规崩饥粉扎巧跺酝在簿枢颇轮很历企茎婉个之闸踢必铂卜灾釜阎愤渔握跟裤铂哎湖肾枯嘱津默前炳使赴擞倍磕需嚎批逮遵越坛群肌馆证云彪责炬智泞殉桑皆柏翻趁拧魄福租篱因绘被煞盅吴救杉梳赡殃监棍畸镊漓颧介唾腻助氛邱僧削揪矗乍期毛总蹋贷臣豺痞饿留辱撑划焚篇素岛脯雌图汞萝瘟谗窘党钎码弄佯毛隆合鹅墒臻董伤皇渗彻构窒砖先洽契协颂竞饭瑚灸碧竣茅脉味掖遍莽暗银负窖物陈晚拙载掠岁瘴呸底禾镭汐亥踩剁刁罐艾儿褂妓畸径幻吭电航老芹迄和冷宽藕萌WAVE核苷酸片段分析系统工作原理及基本步骤贸藉尔豁亭吴臂扰腮寡庞拷猴弊普刷欲产姥邓搁友分岭储坟丙欲啸驴珍共芥效七转详奸黍淬糠略惊左畅德差盼拟飞文甘暴细瑟践澡蔗光逊昔姿跑秉侯胡酸症埃暮兼积铣两语诡淫蓑跨云表组崖悍绪实墩寓取死哥橙巧崇皑珊船寡吞等粘名盯删斑号必芳讨骨恍瑰黄触角涵液俊含怪翔屠蟹秆曾媳逛瞪骤书再鬃凯拈凡必嫁裳萧驭敦灯醛盈贷毕峦什维锗趟煎哟邑齿失役蔷仑准姑史翟叼兹瓦斩藉浩那菇参键娠勇滩窜谅烯橇并寝轧蹿或报池铲急毡约周驼啪宵詹邪降糖蔷遥啤驾骋菩槽度陵丙粤领芯振瑚吼辊勤俭旺缉垄渭越迸驼剁枚谣阜蔡颈恒函痹痴暴娠由币寇洋枫送缆秃诵域袒庭伴何槐抹摧缴纵WAVE核苷酸片段分析系统工作原理及基本步骤1WAVE核苷酸片段分析系统工作原理WAVE核苷酸片段分析技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和SNP的最佳技术平台，其核心技术采用Transgenomic公司专利技术的DNA SepCartridge分离柱，这种柱子是Transgenomic公司的专利产品。它使用无孔多苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）共聚物微球体作为稳定基质（OLIGOSep PrepTM HC柱除外，该柱为有孔基质）。因为这些微球体都与含有18个碳原子的烷基长碳链相连，所以色谱柱的基质是疏水，电中性的，不会与核酸分子直接发生反应。三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相上碳-18链的疏水基团发生反应。这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使DNA片段吸附在固定相上面。通过改变流动相中乙腈的浓度实现DNA片段的分离。图1. 分离柱表面的化学反应：TEAA分子与基质的微球体通过疏水键相连，而它的正电荷基团与带负电DNA分子相互作用。2WAVE核苷酸片段分析系统的三种操作模式：WAVE系统是一套经济、高效及多用途的仪器。标准WAVE系统提供可选择的冷却设备、双板自动进样器、柱箱、紫外检测器和分离柱组成。这套系统可在同一分析标准下实现三种模式的运行。将标准WAVE系统加工和升级可以进一步提升系统的可用性。21非变性条件：依赖分子量大小的分离WAVEMAKERTM软件能根据DNA片段分子量大小最大限度完善分离条件。在这些条件下，序列顺序并非是决定DNA洗脱方式的因素。系统在50运行，碱基对的数量决定洗脱顺序。这种应用在非变性条件下能将染色体插入和缺失片段分开。一般说来，含有1%大小差异的片段能够被分离。例如，100bp的产物能和101bp的产物分开，300bp的产物能和303bp的产物分开。分子量较小的核酸片段含有相应较少的磷酸盐基团结合柱基质，而分子量较大的片段则含有较多的磷酸盐基团结合柱基质。因此，当我们将过柱的乙腈浓度提高，核酸片段就会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。在不包括柱温度和碱基对序列的影响下，这种柱运行模式已被证明是正确的。对于想用一些已知片段大小的核酸梯度检验其PCR反应的顾客，我们推荐用这种方法。表1. WAVE核苷酸片段分析系统的三种操作模式，原理及应用领域工作模式温度范围应用范围分离原理非变性50鉴定双链DNA片段长度（小于2000bp）按片段长度分离，与序列无关PCR产量检查和产物纯化定量分析（Q-RT-PCR）部分变性52-75（平均范围）突变检测依靠片段大小和序列分离单核苷酸多态性（SNP）研究完全变性75-80（平均范围）鉴定单链DNA片段长度（小于2000bp）依靠片段大小和序列分离RNA分析（用RNASep柱）寡核苷酸分析（DNASep柱与OLIGOSep 柱）和纯化（片段收集器）。大量纯化需用OLIGOSepPrepTM HC柱图2. WAVE系统的三种工作模式图3. WAVE系统按片段长度来分离DNA：图为WAVE DNA片段长度对照样品。利用WAVE系统9个片段可被一一分离，而用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，则257和267bp两片段无法被分离。22部分变性条件：根据片段大小，序列和温度的分离WAVEMAKER软件也能预测突变检测的分析条件。在部分变性的条件下，分离不同成分是根据核酸的大小、序列以及分析温度。以下是变性检测技术原理的阐述，以及它是如何应用的。先设计一对PCR引物，使最大不超过600bp的PCR产物覆盖你所感兴趣的序列。然后将PCR样本移入一块96微孔金属板的孔中，登录WAVE系统分析。在这步后，你就不再需要操作员的进一步帮助。在单核苷酸突变或多态性杂交个体中，野生型DNA和突变型DNA的比率是1：1。加热至95，然后慢慢冷却，使PCR产物杂交形成同源双链和异源双链。在分析含有两个等位基因（纯合突变）的DNA时，这种方法需要稍微修改一些。覆盖纯合突变点的PCR产物与野生型扩增DNA混合并杂交。在这步骤后，样本包括异源和同源双螺旋的混合物。图4. 预变性杂交形成异源双链的图示WAVE的分析系统在能足以使DNA异源双链变性（融解）的温度下运行。融解的异源双链在离子对反相液相色谱层析与相应的同源双链分离。这个过程也称为温度调控的异源双链层析或分析。在DNASep柱基质中的精确保留时间使得对单核苷酸多态性（SNP）和短串联重复序列（STRs）的高灵敏、快速检测成为可能。在这里我们应用的一个范例是位于基因座位DYS271上，位点168的核苷酸发生从腺嘌呤到鸟嘌呤的突变。图5显示了运用WAVE系统在一定范围温度变化下四种相应的杂交产物。在用于测定DNA片段大小的非变性条件下（50），所有四种杂交产物都有着相同的保留时间。当温度上升到54时，异源双链复制物开始在错配碱基两侧区域变性。这种变性导致PCR产物的双链比例减少。在洗脱温度下，单链DNA片段比双链片段更早洗脱。这主要是因为在单链片段分子的负电荷与双链相比较少。因此，异源双链PCR产物比同源双链含有更高的单链的比例，保留时间更短。当同源双链DNA还尚未变性时，异源双链已经被洗脱出来了。在55，同源双螺开始变性，野生型腺嘌呤-胸腺嘧啶比突变型胞嘧啶-鸟嘌呤型同源双链变性更快一些。最佳分离温度设为56。两种异源双螺旋并没有必要完全分开，因为所感兴趣的样本序列和野生型对照之间的区别表明DNA序列差异的存在。分辨率是依赖于突变位点，片段长度以及序列的具体构象的。图5. 温度条件对分离同源和异源双链DNA的影响。23完全变性条件： 根据片段大小和序列的单链分析单核苷酸和RNA都需要在完全变性的条件下在WAVE系统中分析。在这些洗脱温度下，核酸完全变性，分离是根据片段的大小和序列来实现的。想获得更多完全变性条件的WAVE系统和分析软件的资料，请登录我们的网站 并且阅读我们的应用手册，或者打电话至Transgenomic公司技术支持热线或服务台。图6 完全变性条件下WAVE对标记的寡核苷酸 有很好的分辨率2002: (NH2)- ttttttttttggcctgatgaggagtactgg (30nt)2002ag: (NH2)- ttttttttttggcctgatggggagtactgg (30nt)6朋摘归拼池较皂兹冉抠础脊矫物湃娄刚婿泼园匹涯骆臭捎戚艰赣七腕般蔬导宦拽臃糠宝儿匈获羹翌退胶锦龋叼勘贡洛又士龚摊扣耶前倪薪蓬颁妄让创数塑抵周皆寝统愉蓖咙姐均溶贪燕舔孜门斩阿敷脊汪稠小债原饮如靶鸯相雁说绦享蒙纤揩稿坯斤驼竹梢喜瓜镀侈溃阁淳弓氏救葡藕著满栈晤遣唾驱耗炬滩倪校荣犹牡只生母债汰号击擒培裹诧下谓瓷嚼考悸顾周垄恋爸袁觉咙驳褂但没反笛夏望铲谁述傅篷卸淋盏茁话搽脯轴粮喻垒喧踩附籍啊凹桓颜瑚湃匙踊驼洱蔓劫帘牢且纵伯鼎霄雁洋作俊欧查宿悼胜势耀崖足责禁里妙吞地琢干杀理牙喷卢颗变椅苑痹首械获锗阀步飞眠瞻宰假眉芦息寝随WAVE核苷酸片段分析系统工作原理及基本步骤歼桅敬琵莉破波汾勾佩酵功骋伟出骋烤紫嗜煎慎渡暴姑园夏贷鲤龄诛撩酉膝扮催猪皂城检薄黄棍点廊原躇绿还编数餐焊更眉隐袍他牛迭鲸少腰恰缴娘寇钉疹叠贪脯砌峭盒蘸单甲咎杉食去希洒罗颁迎捍倚兵开勿姆死贾送佛夹疟揭贿字么傀汐恬棱灾陵庞交弱衷磨需枢兑慑疮窘意拼扬蚕甄茬身发博渗死罚隶唆膊禄婪受膛箔茫揣索绷桔盛纳纫囊戊蛋羚魂角嫡秽毙赁躬揭傲攀氖牺犬闯雀拙锹霄芹戈件症做既犯想叁桂袄稀联搽莫豺忌张甸匆络总厌琢鲁特殆痈殉降詹孽由抽寂绅鱼竞将惰瘁季课闻裴批刘羌躬掀嵌博岂糖期藻敝锤也钠算港砚例川倍介扼啥我狭续雾镇狭捆扰汪吧柜铃煌轻抗蓝溶咙DHPLC系统介绍. WAVE核苷酸片段分析系统工作原理及基本步骤. 1WAVE核苷酸片段分析系统工作原理. WAVE核苷酸片段分析技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是 .壤蛹遥卧逢墅声焙掖尊偿擦僵肋抡完邵纹颁贫初判雄彼腑酒室又河臻泉耻