发热伴血小板减少综合征概述课件.ppt

发热伴血小板减少综合征概述 陈淑红黑龙江省疾病控制中心 SFTSV的发现和研究概况 病毒性出血热 一类由病毒引起的 以发热 出血 休克 多器官损害为主要表现的严重急性传染病 病毒性出血热具有较高病死率 病毒性出血热的病原 主要为4个病毒科沙粒病毒科布尼亚病毒科黄病毒科丝状病毒科均为有包膜单链RNA病毒动物或昆虫作为宿主和媒介 2009 2010年 在河南 湖北和山东等地一些丘陵 山区相继出现病原不明症状类似的病人 主要表现为发热 消化道症状 血小板减少 白细胞减少及多脏器功能损伤等 少数重症病例死亡 中国疾病控制中心对该新发传染病加强监测 利用未知病原快速筛查技术体系 在湖北和山东3名患者血清中同时发现新病毒基因序列 从湖北 山东 河南 安徽 江苏 辽宁6省病人血清标本中分离到20株同种病毒 解析了6省11株新病毒全基因组信息 并从70 急性期病人血清中检测到病毒RNA 确诊病人恢复期血清中特异性抗体转阳或4倍增高 鉴定新病毒 研究工作从病原体分离鉴定到病因关系的论证 成功确定该新发传染病病原为 布尼亚病毒科白蛉病毒属的新病毒 命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒 Severefeverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirus SFTSV SFTSV一般生物学特性 SFTSV人感染后可出现病毒血症 从早期病人血清中可分离到病毒 病毒感染细胞谱较广 培养上清超滤浓缩后经蔗糖密度剃度离心可获得纯化的病毒颗粒 在电镜下呈球形或椭球形 直径约80 100nm 病毒颗粒有双层脂质包膜 包膜表面有糖蛋白形成的突起 内有病毒基因组与核蛋白形成的核衣壳结构 目前国际上公认将白蛉病毒属病毒分成两大组 一组是对人类致病的 如立夫特谷热病毒等 另一组一般对人类不致病 如乌库病毒等 新发现的SFTSV为白蛉病毒属第三组病毒 SFTSV感染流行病学特征 我国目前已在河南 湖北 山东 江苏 安徽 辽宁 浙江 江西8省发现发热伴血小板减少综合征 SFTS 病例 多散发于呈丘陵地貌的农村地区 呈散在分布 发病时间一般开始于3月 高峰期在5 7月份 可延续至11月份 SFTSV易感人群年龄分布在39 83岁之间 其中50岁以上患者占75 没有明显性别差别 宿主和媒介 SFTSV传播媒介主要是蜱虫 人类可通过蜱虫叮咬而得病 已从长角血蜱中分离到SFTS病毒 其核酸序列与人源病毒具有95 左右同源性 SFTSV宿主范围较广 病毒可感染牛 羊 狗等脊椎动物和蜱等节肢动物 在牛 羊 狗 鸡 猪血清中存在SFTS布尼亚病毒抗体 并已从牛 羊 狗中分离到病毒 发现SFTS死亡病人血清中病毒载量可达107TCID50 直接接触高感染性病人血液可导致人 人直接传播 SFTSV病毒循环 SFTS临床特征及致病机理 SFTS患者没有特异的临床症状 主要表现为发热和胃肠消化道症状 可见局部淋巴结肿大 实验室化验常见血小板减少 100 和白细胞减少 99 大多数患者很快发展为多器官功能异常 表现为血清中谷丙转氨酶 谷草转氨酶 乳酸脱氢酶 磷酸肌酸激酶 磷酸肌酸激酶同工酶水平升高 常见蛋白尿 84 和血尿 59 临床特征 绝大多数患者预后良好 少数病例病情危重 出现意识障碍 皮肤淤斑 消化道出血等 可因休克 呼吸衰竭 弥漫性血管内凝血 DIC 等多脏器功能衰竭死亡 动态监测结果显示幸存者中病毒载量多在发病后7天开始下降 但病死者其病毒载量仍维持在较高水平 可发生经血液人 人传播 在发病第7 13天 血清病毒载量 血清谷草转氨酶 乳酸脱氢酶异常提示可能会导致更为严重的出血症状 中枢神经系统症状 DIC MOF及血清中组织酶升高 病死率约12 左右 新型布尼亚病毒的致病机理尚待更多的临床数据和实验室研究进行阐明 选取发热伴血小板减少综合征病不同预后的患者 利用Luminex技术平台 检测了27种细胞因子的动态变化 并通过标准曲线对每种因子进行定量 致病机理 研究结果显示SFTS患者急性期血清中促炎性细胞因子IL1 RA IL 6 IL 8 IL 10 MCP 1 G CSF及IP 10水平大幅度提升 而PDGF BB和RNATES水平则显著降低 且病毒载量与血清细胞因子水平具有相关性 研究结果提示高病毒载量可能会导致危重病人的严重病理变化 而促炎性细胞因子异常可能与SFTS症状加重有关 在SFTS患者血清中几乎检测不出 干扰素 已有的布尼亚病毒的研究认为 布尼亚病毒科的病毒通常不能有效促进抗病毒复制的干扰素生成 有些非结构蛋白具有拮抗干扰素的作用 基于这些资料推测 新型布尼亚病毒可能通过抑制靶细胞生成干扰素而在体内复制 在这一过程中可通过诱导机体产生炎症性趋化因子而引发后续的免疫炎症反应 将从患者血清中分离的SFTSV接种到小鼠体内 在感染急性期可引发特征性临床症状 即血小板减少和白细胞减少发现病毒核酸在血 肝 脾 肾中均可检出病毒感染可有效地诱导病毒特异性IgM IgG以及中和抗体的生成发现SFTSV在肝 脾 肾引起显著病理变化 与临床观察到的肝肾损伤症状一致 SFTSV感染动物模型 免疫学 病理学 发现脾巨噬细胞为病毒感染复制的靶细胞 在SFTSV感染的脾组织中 巨噬细胞大量增加 血小板也出现大量沉积 并且荧光共定位研究显示病毒与血小板共定位于巨噬细胞的胞浆中 结合细胞学实验发现SFTSV可以黏附于人血小板并引发巨噬细胞对血小板的吞噬 目前的研究提示SFTSV感染导致的血小板减少可能是由于脾巨噬细胞对病毒黏附血小板的异常清除所致 SFTSV实验室检测方法 标本 病人血清病毒核酸诊断病毒特异性IgM抗体诊断病毒分离培养双份血抗病毒IgG抗体检测 免疫荧光 ELISA 空斑减少或微量中和试验检测中和抗体 SFTSV病毒感染的动态指标与检测 核酸检测流程图 常用PCR检测方法 常规PCR检测单轮PCR检测2轮PCR检测 套式或半套式PCR 实时定量PCR基于SYBRGreenI的PCR检测基于探针的PCR检测方法 HybProbe Taqman根据检测靶标单元PCR检测方法多元PCR检测方法 核酸检测流程 反应体系混合物正 反向引物混合物特异性荧光探针 1 核酸分离 2 Real timePCR检测 20 l 5 l 反应条件取决于病原体特异性 PCR仪 合适的PCR管 1 带手套2 注意及时更换手套 尽量保持分离RNA的管子封闭 3 分离RNA保持在冰上4 使用灭菌和无RNA酶的耗材5 用0 1MNaOH 1mMEDTA 或氯仿 和无RNA酶水冲洗塑料耗材 玻璃器皿使用含去污剂的水反复冲洗 然后240 干烤4小时 或充满0 1 DEPC的水37 过夜 或不少于孵育12小时 6 溶液 如果不能确认是否无RNA酶 RNase free 应用0 1 DEPC处理 7 分离的RNA保存于 20 或以下冰箱 避免反复冻融 可考虑添加额外的RNA酶抑制剂 需要时再分离RNA 核酸检测的注意点 防止RNA酶污染 PCR交叉污染的来源与控制 PCR不需无菌操作 但应十分注意交叉污染常见的污染源 以前PCR扩增产物的污染 样本处理污染 交叉污染的控制 隔离操作区 至少有三个区域 标本核酸分离 PCR反应体系配制 PCR扩增及结果分析 实验中尽量减少各区之间交叉走动 穿着不同工作服 操作技能 戴手套并及时更换 仔细操作 液体应该分装 用防气溶胶的吸头 妥善处理废弃物 污染的处理 及时清除操作废弃物次氯酸 2 5 70 乙醇擦拭污染的工作区表面次氯酸 2 5 过夜浸泡使用过的PCR管存放架等以备下次使用耗材从仓库直接运送到PCR操作间 不经过不必要的实验室UV照射 表面 液体等 由于UV对500bp以下的DNA损害很小 所以可以处理已加入引物的反应液 内切酶和DNaseI可以对未加入模板和Taq酶的PCR反应液进行处理 处理完后加热灭活这些酶 然后进行PCR反应 尿嘧啶DNA糖基化酶 UDG 2020 1 29 35 可编辑 SFTSV细胞培养分离与鉴定 1目的用于患者 宿主动物及媒介生物标本中发热伴血小板减少综合征病毒 SFTSV 细胞培养分离与鉴定 2适用范围适用于SFTS患者 宿主动物及媒介生物样本的检测 3 样品接收和准备3 1核对被检患者的姓名 性别 年龄 编号及检测项目 核对被检样本的来源 种类 编号 检测项目等 3 2用于检测的待测样品不能及时检测的储存在 70 4 实验原理标本中病毒通过在敏感组织细胞中培养放大 有利于病毒的进一步分析与鉴定 可以用来分离SFTSV的敏感细胞包括 Vero Vero E6等 SFTS血清学检测方法 1 捕获法Mac ELISA2 间接法ELISA3 双抗原夹心法ELISA4 双抗体夹心法ELISA5 空斑减少中和试验 IgM捕捉法ELISA检测SFTSV的IgM抗体 1目的检测SFTSVIgM抗体 2适用范围适用于患者血清或血浆中SFTSVIgM抗体的快速检测 3 样品接收和准备3 1核对被检样品 血清或血浆 3 2人血清或血浆 含有EDTA 柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本试验 样品中无微生物 可在2 8 储存一周 超过此期限建议 20 以下冻存 避免反复冻融 使用前将样品室温平衡30分钟以上 冷冻样品实验前需混匀 间接法ELISA IgG抗体 1目的 检测新布尼亚病毒IgG抗体 2适用范围 适用于血清或血浆中抗新布尼亚病毒IgG抗体的快速检测 3 样品接收和准备3 1核对被检样品 血清或血浆 3 2本试剂使用人血清或血浆 含有EDTA 柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本试验 样品中无微生物 可在2 8 储存一周 超过此期限建议 20 以下冻存 避免反复冻融 使用前将样品室温平衡30分钟以上 冷冻样品实验前需混匀 双抗原夹心法ELISA 总抗体 1 目的 检测发热伴血小板减少综合征病毒 SFTSV 特异性抗体 2适用范围 适用于人或宿主动物血清或血浆中SFTSV抗体的快速检测 3 检测原理 本方法采用纯化的重组SFTSV核蛋白抗原包被酶标板 结合样本中SFTSV特异性抗体 再加辣根过氧化物酶标记的核蛋白抗原和已被板上抗原捕获的抗体反应 用以检测SFTSV特异性抗体 适用于SFTSV感染状况的调查及其它实验性研究 当恢复期样本总抗体滴度较急性期有4倍或4倍以上升高时 具有诊断意义 SFTSV双抗体夹心法酶联免疫吸附试验 1目的检测发热伴血小板减少综合征病毒 SFTSV 抗原 2适用范围适用于检测组织培养 媒介 宿主动物标本 患者急性期血中SFTSV抗原检测 3检测原理本方法采用病毒特性性多克隆抗体包被酶标板捕获标本中病原抗原 加病毒特异性单克隆抗体结合病毒抗原 用以检测病毒抗原 SFTSV空斑减少中和试验 1目的 检测发热伴血小板减少综合征病毒 SFTSV 中和性抗体和血清分型 2适用范围 适用于诊断 血清流行病学调查3样品接收和准备3 1核对被检样品患者的姓名 性别 年龄 编号及检测项目等 3 2用于检测的待测样品 如不能及时检测储存在 20 4 检验原理空斑就是对活性染料 中性红 不着色的被病毒破坏的死细胞灶 有些病毒尽管不形成细胞病变却可使细胞的一些代谢机制受影响 如对中性红的吞噬能力减弱或丧失 在着色的活细胞单层红色背景衬托下呈无色的斑点既空斑 测定形成空斑的数量可准确地了解病毒的感染滴度 获得比50 细胞培养感染滴度 TCID50 更准确的结果 利用抑制病毒繁殖减少空斑形成数 可提供一种测定血清中中和抗体和抗病毒物质的敏感方法 SFTS样本的包装运输与准运申请 您将会知道 感染性物质的正确包装与分类感染性物质的正确运输与申请 法律 法规依据 国务院第424号令 病原生物实验室生物安全管理条令 2004年11月12日起实施卫生部第45号令 可感染人类的高致病性菌 毒 种或样本运输管理规定 2006年2月1日起实行 相关文件 卫生部制定 人间传染的病原微生物名录 2006年1月11日起发布国际民航组织 危险物品航空安全运输技术细则 Doc9284包装说明PI602 感染性物质定义及分类 感染性物质是那些已知或有理由认为含有致病原的物质 国际民航组织 危险物品航空安全运输技术细则 中将感染性物质分为A B两类 名录 要求 通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装 SFTSV属于A类标准的感染性物质 感染性物质的A类包装 A类 对健康人或动物造成永久性残疾或致命疾病的感染性物质 包装 最耐用的三层包装 并附上完整的危险品申报表 运输人员的培训 感染性物质的A类包装 航空运输A类包装 UN2814号 感染性物质的A类包装 A类包装主容器 感染性物质的A类包装 A类包装次级容器 感染性物质的A类包装 A类包装外包装 A B类包装的异同点 A类 B类包装的相同点三层包装主容器和辅助包装 都能承受 40 至 55 温度范围内95kPa的内部压力而无渗透 完整的包装必须都能通过 危险物品航空安全运输技术细则 规定的跌落测试 包装上都有包装标识 联系人 地址等 样本运输 可感染人类的高致病性病原微生物菌 毒 种或样本运输管理规定 第三条本规定适用于可感染人类的高致病性病原微生物菌 毒 种或样本的运输管理工作 第四条运输第三条规定的菌 毒 种或样本 应当经省级以上卫生行政部门批准 未经批准 不得运输运输审批权限 省内运输由省级卫生主管部门批准 省际和国际运输由省级卫生主管部门初审 报卫生部批准 样本运输 第六条申请运输高致病性病原微生物菌 毒 种或样本的单位 在运输前应当向省级卫生行政部门提出申请 并提交以下申请材料 1 病原微生物菌 毒 种或样本运输申请表 2 法人资格证明材料3 接受单位同意接受证明文件 4 病