实验七 流式细胞仪检测技术.doc

实验七 流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。实验原理 流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式，特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。实验应用流式细胞仪主要有两个最基本的用途：第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。1. 免疫细胞群的分类 静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。例如,B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特征性的表面标志，将细胞分为不同的群或亚群。2. 免疫细胞的分化发育 免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。3. 免疫细胞的分子表达 免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。例如，静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。因此，可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。4. 免疫细胞的分离 如前所述，免疫细胞是一组极不均一的群体。所以在研究免疫细胞功能时，常常需要把某些特异的细胞分离和纯化。虽然免疫细胞分离的方法很多，但用FACS来纯化特定的细胞群是目前最为有效和方便的手段。例如，最近颇受关注的CD4+CD25+T淋巴细胞是一群具有免疫调节（免疫抑制）功能的细胞群。在对其特点及功能进行研究时，首要的问题是分离该细胞群。用相应的单克隆抗体与其结合，再用FACS进行分离，就能得到纯度很高CD4+CD25+T淋巴细胞细胞群。而其他分离方法不仅分离过程烦琐，也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。实验方法流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。（一） 细胞和试剂的准备材料（1）细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。（2）荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE(phycoerythrin)标记的单克隆抗体。（3）封闭抗体：抗Fc受体抗体 免疫细胞表面一般表达有Fc 受体，能和抗体的Fc段结合。封闭抗体的作用就是阻断荧光标记的单克隆抗体的Fc段与免疫细胞表面Fc受体结合所产生的非特异性的结果。（1） FACS缓冲液： 1PBS 950ml FCS 40ml 10%叠氮钠溶液 10ml（2） 仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供（3） FACS清洁液（FACS clean ）和FACS洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供。操作步骤（1） 单细胞悬液的制备：将11051107的细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100l悬浮细胞。（2） 封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5l（0.5mg/ml），水浴3分钟。（3） 细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1l（0.5mg/ml），水浴30分钟。（4） 洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350l，轻轻混匀，3000r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。（5） 上样前处理：取100l仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。（二） 仪器的操作以FACSCaliburTM(BD Biosciences)仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwere）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。1.使用前的准备（1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。（2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。（3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。（4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。2.使用中的操作（1） 计算机部分使用CELLQuest程序系统软件：设定所要检测细胞的数量：一般设10 00020 000个细胞。命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）(表11-1)：如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dot plot）或轮廓线图（contour plot）表 CD69分子表达检测直方图的数值说明 a.anti-CD3(-)检测结果markerLeft,rightevents%gated%totalmeanGeo,meanCVmedianPeak ChAll1,991010000100.00100.0012.064.591453.373.221M11,105996999.6999.698.044.53134.413.221M2105,9910310.310.311304.57309.78223.13164.00112b.abti-CD3(2ng/ml)检测结果markerLeft,rightevents%gated%totalmeanGeo,meanCVmedianPeak ChAll1,991010000100.00100.00200.5348.90193.6861.531M11,100577657.7657.7624.4111.69109.2212.861M2100,9910423742.3742.37440.31344.57114.76361.90417c.abti-CD3(10ng/ml)检测结果markerLeft,rightevents%gated%totalmeanGeo,meanCVmedianPeak ChAll1,991010000100.00100.00236.9074.05155.88113.42495M11,90460246.0246.0225.1312.83101.6714.421M290,9910542554.2554.25415.81327.83102.28349.12495CD4及CD8细胞点状二维图结果quadevents%gated%totalXmeanXgeo.meanYmeanYgeo.meanUL161416.1416.143.682.99346.86291.03UR742574.2574.2599.3876.39308.36256.26LL5585.585.584.003.399.916.88LR4034.034.03123.3293.657.144.35不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表用于FACS的荧光物荧光物激发波长（nm）FITC525(green)PE575(orabge-red)RED613610(red)PI620(red)PerCP650(red)TRI-COLOR650(red)CyChrome670(red)(2)细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。3.使用后的清洗 所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。（1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。（2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入 1分钟。（3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。（4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。（5）最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器。（6）将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。应用举例(一)小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子表达的检测a .简要说明(1)细胞为小鼠胸腺细胞。(2)抗体为PE标记的抗CD4抗体和FITC标记的抗CD8抗体。b.结果 以点状二维图（ dot plot）表示，见表11-2。横坐标为CD8分子，纵坐标为CD4分子。所以右上代表双阳性细胞群，左下代表双阴性细胞群，左上代表CD4+CD8-的单阳性细胞群，右下代表CD4-CD8+单阳性细胞群。c.结果分析 胸腺中存在着发育不同阶段的胸腺细胞，这些发育不同阶段的胸腺细胞表达CD4及CD8分子存在着差异。上面的结果是正常小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子的表达情况：存在着4种亚群：CD4-CD8-的双阴性细胞群（5.6%），CD4+CD8+的双阳性细胞群（74.3%），CD4+CD8-的单阳性细胞群（16.1%）和CD4-CD8+的单阳性细胞群（4.0%）；在这4种亚群中以CD4+CD8+的双阳性细胞群为主（75%）。(二)小鼠脾细胞中T细胞和B细胞的组成1. 简要说明（1） 细胞为小鼠脾细胞（2） 抗体为PE标记的抗CD3抗体和FITC标记的抗CD45R抗体2. 结果 以点状二维图表示，见表11-4。横坐标为B220分子，纵坐标为CD3分子。因此，左上为T细胞群，右下为B细胞群。3. 结果分析 在脾脏中主要存在有两大类淋巴细胞群T细胞和B细胞。其中B细胞占60%左右，T细胞占30%。B220及CD3细胞点状二维图结果quadevents%gated%totalXmeanXgeo.meanYmeanYgeo.meanUL306730.6730.672.362.0887.3950.96UR3713.713.71183.9586.411888.23141.27LL6196.196.193.773.233.823.07LR594359.4359.43215.54186.491.911.60(三)活化T细胞CD69分子的表达1.简要说明（1） 成熟T细胞来自正常小鼠脾脏，经纯化而获得，通常情况下T细胞处于静止状态，而在不同浓度的抗CD3抗体的刺激下T细胞活化。（2） 抗体为FITC标记的抗CD69抗体。2. 结果 以直方图表示，参见表11-1。横坐标为荧光的强度，纵坐标为具有相应荧光强度的细胞数。3. 结果分析 在没有抗CD3抗体刺激时，绝大多数处于静止状态的T细胞不表达CD69分子（CD69+0.3%）；在2g/ml抗CD3抗体刺激下，42.4%的 T细胞表达CD69分子；在10g/ml抗CD3抗体刺激下，54.3%的T细胞表达CD69分子。说明静止的T细胞不表达或表达较少的CD69分子，而活化的T细胞则表达高水平的CD69分子，并且该分子的表达随着活化的强度而增加。因此，检测CD69分子可作为T细胞活化的标志。关键点(1)减少非特异荧光染色细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗23次，以除去游离的抗体。(2)单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。(3)如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。实验八 杀伤细胞功能的检测杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，免疫系统中有多种具有杀伤功能的靶细胞，如自然杀伤细胞（NK）、细胞毒性T细胞（CTL）、具有ADCC作用的单核细胞巨噬细胞等。在体外，多种细胞因子（如IL-2）可明显促进某些效应细胞的杀伤功能（如LAK），此外，通过识别靶细胞某些膜分子的抗体可介导重导向杀伤功能。本章主要介绍NK、LAK和重导向杀伤试验。由于混合淋巴细胞培养（MLC）可诱导出NK、CTL和LAK靶细胞，因此在本章一并介绍。一.自然杀伤细胞（NK）和淋巴因子激活杀伤功能（LAK）的检测原理NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中，能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞，无需抗原或有丝分裂原刺激，也不依赖抗体或补体，在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。通过将同位素51Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞Libr（黑色素瘤细胞），按一定细胞比例与效应细胞（NK或LAK）孵育4小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的51Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。试剂和器材1. 细胞系：K562、LiBr2. 10%FCS RPMI 16403rHu IL-24. 3H-TdR、51Cr5培养瓶、培养板、CO2孵箱、离心机6-液闪仪、-计数仪操作步骤1 效应细胞的制备NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腺水）中分离的淋巴细胞（1106/ml）在含有高剂量IL-2（2001000ul/ml）的10%FCS RPMI 1640诱导25d而成。2 杀伤试验 主要有51Cr4h释放法和3H-TdR释放法，前者操作时间短，非常敏感；后者需要无菌操作，所需时间较长。（1） 51Cr4h释放试验：收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2106/ml取1106细胞（0.5ml），加Na251CrO4 100uCi,37度孵育23h，每15min轻轻振摇一次。用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800rpm、5min。重悬细胞浓度1105/ml。96孔v型或U型培养板中，每孔加100ul（1104细胞），设3个复孔。每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100ul1%Triton X-100；自然释放组加100ul完全培养基。200g离心1min。37度、CO2孵箱培养4h。200g离心1min。每孔取出100ul上清，计数仪测定值。计算：特异性杀伤率（%）=（实验组cpm-自然释放cpm）/（对照组-自然释放cpm）（2） 3H-TdR释放试验 收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2106/ml，加3H-TdR 20uCi。7度孵育23h。用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800rpm、5min，调整浓度为1105/ml。96孔U型或平底培养板中，每孔加100ul（1104细胞），设3个复孔。每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100ul1%Triton X-100；自然释放组加100ul完全培养基。CO2孵箱培养1824h。每孔取出100ul上清，加入胰蛋白酶（终浓度0.15%）和DNA酶（终浓度为0.0125%）继续孵育30min。用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。烤干后，计数仪测定值。计算：特异性杀伤率（%）=（1-实验组cpm/对照组cpm）100%（二） 注意事项 1每次试验最好取34个不同的效应细胞/靶细胞比例，常用效靶比例为100：1、50：1、25：1、12.5：1。 2诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。 3避免同位素污染。 根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，常用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞（见表）。用Percoll不连续密度梯度离心纯化人NK细胞加样细胞梯度顺序12345Percoll浓度（%）40.042.545.047.550.0细胞回收率（%）1001.63.58.528.521.5LGL（%）125827472LU/107细胞421619214341 1个溶解单位（Lytic unit,LU）为一定效应细胞30%溶解（杀伤）5103/靶细胞（K562）的水平。如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。具体方法是将Percoll分离的位于第2、3梯度间的细胞洗涤后，调整细胞浓度为5106/ml，移入试管，加入2mlFCS和2ml 1108/ml SRBC，100g离心5min，29度孵育1h，轻轻重悬细胞，叠加于3mlFicoll上，400ug室温下离心30min，界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可大于90%。在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用N H4Cl方法，因为后者可降低NK功能。在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄。 不同小鼠系NK活性的差别NK高水平系CBA/JC3H/JC57BL/6C57BL/10DBA2NK低水平系A/SnA/JAKRSJLBALB/c 三周内或3月龄以上小鼠的NK水平一般很低。二、混合淋巴细胞培养混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）以往为用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此MLC又是免疫调节研究中常用的实验模型。 原理两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLA类抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此外双向混合淋巴细胞培养（two way MLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂酶C处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（one way MLC）。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。EB病毒转化的B淋巴细胞表达高水平的HLA类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。 试剂器材 1细胞：刺激细胞N23细胞系，反应细胞：外周血单个核细胞。 210%FCS RPMI 1640培养基。 3照射源：60Co装置 4细胞培养瓶、培养板、滴管、吸管等。 5CO2孵箱、超净台。 操作步骤 1刺激细胞的准备：常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴细胞（如N23细胞）或PBMC。取处于对数生长期的N23细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中，调整细胞数为1106/ml2106/ml，移置于塑料培养瓶或者50ml离心管中，用60Co照射3000rad。 2反应细胞的准备：分离纯化待检个体的PBMC。 3 LC：按2106PBMC与1105经3000rad照射的N23细胞的比例，重悬于4ml10%FCS RPMI 1640,放置于小培养瓶中进行MLC，培养瓶保持直立，培养4d内不要晃动，第5d加入1ml新鲜培养基。如要测定3H-TdR掺入率，一般可在MLC的第5d进行；如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞（CTL），一般在710 d左右收获效应细胞。杀伤细胞功能检测参见本章“自然伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞的杀伤功能”，所不同的是CTL的靶细胞选用作为刺激细胞的N23细胞。注意事项 1注意无菌操作 2刺激细胞接受照射剂量要准确，是细胞暂时存活，但失去增殖的能力。 3可用RAJI或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。不同刺激细胞与反应细胞的合适比例有所不同，应做预实验选择最佳的实验条件。实验九 吞噬功能试验一中性粒细胞吞噬功能测定试剂与材料 2g/L NBT盐水（室温搅拌1小时或80度水浴中搅拌溶解，滤纸过滤，4度保存有效期36个月），用时与Ph7.2 0.15mol/L PBS等量混合，即为工作液。肝素、甲醇溶液、10g/L沙黄水溶液、小试管、毛细滴管、玻片、温箱以及显微镜等。试验步骤 采用硝基蓝四氮唑还原试验。（1） 试管法： 肝素抗凝血0.1ml滴于小试管底部，再加入等量NBT应用液37度，30分钟（中间摇动一次），再置室温15分钟摇匀，用毛细管取一滴放于玻片一端，做血涂片立即用电吹风吹干，甲醇溶液固定1分钟，10g/L沙黄水溶液染色5分钟PBS冲洗、自然干燥、油镜检测(2)微量法：取硅油处理的1mm75mm的毛细管取末梢血至30mm处立即吹入硅油处理的凹玻片中，与1/30量的0.05%肝素溶液混合加等量的1g/L NBT，轻轻摇动混合，湿盒内，37度，室温15分钟用毛细管吸去表层上清液，用硅油处理的毛细管吹数次混匀吸出少许制成血片，空气干燥，沙黄水溶液染色，油镜观察试验结果 血片中有10%以上的中性粒细胞的胞质中有蓝紫或蓝黑颗粒沉着，其沉着颗粒形状大小不一，有的呈大块状，有的呈点状或放射状。关键问题 NBT配制一定要完全溶解，滤液要呈透明的淡黄色，储存于棕色瓶中，NBT应用液应于用前配制。血涂片要求推出尾部，不可过厚或过薄。血液与NBT要充分混合，保温时间不能过长。 二小鼠巨噬细胞吞噬功能测定试剂与材料：昆明种小鼠（体重1822g）、用生理盐水配制的10g/L淀粉溶液、2鸡红细胞、肝素注射液、瑞士姬姆萨染液、注射器、毛细管、解剖用具。实验步骤：小鼠腹腔注射10g/L淀粉溶液2ml 24h后，小鼠腹腔注射2鸡红细胞1ml30min后，小鼠脱臼处死，腹腔内注射0.2ml肝素注射液，揉动腹部 毛细管吸取腹腔液，滴一滴于玻片上，将毛细管平放于液滴上展开液滴，自然干燥 瑞士姬姆萨染液染色5min，pH7.2PBS浸泡56min自然干燥后，油镜观察结果判定 观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，计数200个局势细胞，以及其中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，计算吞噬百分率。三、人巨噬细胞吞噬功能测定实验材料 （1）斑蟊浸液制备：斑蟊以95乙醇溶液制成10酊剂，室温下浸泡2周后使用。 （2）人巨噬细胞的获取：取滤纸片蘸斑蟊酊，置于一侧前臂皮肤上，在滤纸片上盖一塑料片，再以清洁纱布固定45小时，取下滤纸片，再用塑料瓶盖将局部罩上，以防形成的水疱破裂，48小时即可形成完整的水疱。实验步骤 取水疱渗出液0.5ml，加5鸡红细胞悬液0.01ml 混匀，置37水浴30分钟（每10分钟轻轻摇晃一次） 1000r/ min离心5分钟，弃上清，留少许液体混匀细胞，涂片 用甲醇溶液固定后，用瑞士姬姆萨染色，油镜观察关键点 细胞涂片要轻，以免推破巨噬细胞。涂片不可过厚或过薄，以免影响观察结果。 斑蟊酊剂皮肤炎性渗出液大多再1ml，最多的可达6ml，渗出液中所含巨噬细胞平均为3040%，最多可达80。抽取水疱液时，将皮肤消毒后，用无菌注射器抽取，盛于无菌试管中；局部敷以无菌纱布，24小时后取下纱布。用此方法病人无痛苦及不良反应。实验十 细胞因子活性检测检测细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和知道临床治疗均具有重要意义。细胞因子的检测主要分为免疫学、生物学和分子生物学三种检测方法。免疫学方法主要采用双位点ELISA法定量检测细胞因子，分子生物学方法主要检测细胞因子mRNA表达水平。本部分只介绍生物学方法检测细胞因子活性，其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即靶细胞）的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的生物学活性单位。一、IL-1生物学活性检测白细胞介素-1（IL-1）主要是由活化的单核-巨噬细胞合成和分泌的一种细胞因子，具有活化淋巴细胞、协同刺激胸腺细胞增殖、参与抗体产生和促炎症反应等多种生物学功能。IL-1有IL-1和IL-1构成，结合同种受体，表现相同的生物学活性。用于检测IL-1生物活性的方法有多种，如小鼠胸腺细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法、EL-4细胞测定法等。小鼠胸腺细胞增殖法IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时，IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过3H-TdR掺入法或染料摄入法判定小鼠胸腺细胞增殖量，推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性，可了解单核-巨噬细胞等的功能。试剂与材料（1）10%FCS-RPMI-1640培养液。 （2）LPS 用10% FCS-RPMI-1640配制10ug/ml。 （3）刀豆蛋白A（ConA） 用10% FCS-RPMI-1640配制2.5ug/ml。 （4）3H-TdR （5）C57BL小鼠，610周龄，雌雄均可。 操作流程 （1）小鼠巨噬细胞产生IL-1的诱导 常规收集小鼠腹腔巨噬细胞，10%FCS-IMDM培养液悬浮细胞2106/ml，接种于24孔培养板，0.5ml/well。 每孔加20ug/ml LPS0.15ml，37度，5%CO2孵育3648小时。 此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1，收集培养上清，12000r/min离心15分钟，将上清移入新的1.5ml试管中，-20度冻存。 （2）IL-1的生物学活性测定 胸腺细胞的制备：颈椎脱位处死小鼠，无菌取胸腺至于平皿中，加入5ml10%FCS-IMDM培养液，200目不锈钢网制成单个细胞悬液；1500r/min离心10分钟，再用5%Hanks液洗涤细胞2次后，重悬于10%FCS-IMDM培养液中，调细胞浓度为1.0107/ml。 加样：取胸腺细胞加入96孔细胞培养板，0.1ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品，50ul/well，实验孔再加入50ul ConA（终浓度0.625ug/ml），同时设培养液对照孔（0.1ml细胞+0.1ml培养液）、ConA对照（0.1ml细胞+50ul培养液+50ul ConA），均设3复孔。37度，5% CO2孵育3660小时。 3H掺入：每孔加1.851010uBq/20ul（0.5uCi/20ul）3H-TdR，继续培养8小时。 测定：多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪测定3H-TdR掺入量（cpm）以净cpm值（实验孔- ConA对照孔cpm值）为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。关键点 （1）吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时，必须离心，以除去细胞及细胞破碎成分。 （2）ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量，即选择能够激活胸腺细胞，又不引起明显增殖的量，如果ConA过量，则不能有效反应IL-1的刺激活性。二、IL-2生物学活性检测白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。试剂与材料 （1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。 （2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4度避光保存。 （3）IL-2标准品。 （4）PHA（200ug/ml）。 操作流程 （1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生： 人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO2孵育48小时。 回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。 （2）IL-2生物活性测定 CTLL-2细胞制备：取传代培养2448小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1105/ml。 加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100ul细胞+100ul培养液）。37度，5% CO2孵育40小时。 MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5% CO2孵育2小时。 测定：离心培养板，2000r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。 计算：用标准品浓度和对应的净A570nm值（实验孔-阴性对照孔的A570nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。关键点 （1）CTLL-2细胞存活率应大于95%。 （2）因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最好采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。三、IL-4生物学活性检测IL-4主要是由TH细胞活化后产生的一种细胞因子。CT.4S细胞为IL-4的依赖细胞株，对IL-2呈现低反应性，其增殖反应与IL-4的活性呈正相关系。检测IL-4的生物学活性水平，可间接了解TH2细胞及与抗体介导的一些体液免疫的功能。试剂与材料 CT.4S细胞株，A23187（钙离子载体）（用生理盐水配制成0.1ug/ml浓度）。其他同IL-2测定。 操作流程 （1）IL-4诱生 人PBMC分离：淋巴细胞分层液常规分离PBMC，用10%FCS-IMDM培养液调细胞浓度为1106/ml。 加样：将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。再分别加0.25mlPHA（200ug/ml）和0.25A23187（0.2ug/ml），37度，5% CO2孵育24小时。 回收上清：将细胞培养板1500r/min离心10分钟，收集细胞培养上清液，-30度冻存。 （2）IL-4生物学活性测定 CT.4S细胞悬液制备 接种细胞于96孔培养板 加待测样品和标准品 加3H-TdR 收集细胞，测定3H-TdR掺入量 绘制标准曲线，计算待测样品的IL-4的活性单位 *注：用0.25%胰酶消化、收集生长旺盛的贴壁CT.4S细胞；经Hanks液离心洗涤2次后，10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1105/ml。 接种细胞于96孔细胞培养板，每孔0.1ml。加入适当稀释的待测样品和标准品，每孔.ml。每个样品设个复孔，同时设培养液对照。37度，5% CO2孵育小时。与同IL-2。以cpm为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-4标准品浓度为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-4含量。 关键点 在IL-4诱生过程中，常同时产生一定量的IL-2，将影响IL-4的检测结果。因此，最好采用IL-2mAb吸附剂除去IL-2。四、IL-6生物学活性检测MH60.BSF2为IL-6依赖细胞株，MH60.BSF2细胞增殖量同IL-6的生物学活性呈正相比。试剂与材料 同IL-2的生物学活性检测。 操作流程 （1）IL-6的诱生：诱生过程与IL-2基本相同。用于诱导产生IL-6的细胞可用PBMC。诱生剂用PHA。 （2）IL-6的生物学活性测定：采用MH60.BSF2细胞增殖法，测定过程IL-2。应用的MH60.BSF2细胞浓度为2105/ml。五、IL-8生物学活性检测IL-8中对中性粒细胞具有激活和趋化作用，通过检测中性粒细胞的迁移距离可以确定IL-8的生物学活性，即对中性粒细胞的趋化活性。试剂与材料（1） 6%右旋糖酐生理盐水溶液。（2） 淋巴细胞分层液比重为1.077+（-）0.001。（3） 2%琼脂糖：称取2g琼脂糖，加入到100ml蒸馏水中，煮沸溶解。（4） 0.1%白明胶Hanks液。（5） DMEM培养液（2浓缩），内含20%FCS和0.75mg/mlNa2CO3溶液。（6） 甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。（7） 洁净载玻片。（8） 打孔器，直径为3mm。 操作流程 （1）IL-8的诱生 常规分离PBMC，洗涤后，调细胞浓度为5106/ml。 将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。 加诱生剂LPS（20ug/ml），每孔0.5ml，37度，5% CO2孵育48h。 离心收集细胞培养上清液，用HCl溶液调为酸性（PH4.0），经SephadxG-75柱分离，收集活性组分即为待测的IL-8粗品。（2）IL-8的生物活性检测 琼脂板的制备；取溶化后50度左右保温的2%琼脂糖与等体积50度水浴预温的DMEM培养液（2浓缩），混合，取3ml加到洁净的载玻片上，铺成薄层，室温凝固后，放4度，进一步凝固3060分钟，红打孔器打孔。 中性粒细胞制备：常规分离人外周血中性粒细胞。 加样：取10ul中性粒细胞悬液加入琼脂板各组中心孔，分别取10ul待检样品及阳性对照品加入样品孔，取10ulDMEM培养液加入对照孔；将玻片置于湿盒内，37度温育2小时。 染色：用甲醇溶液固定30分钟，用瑞氏染液染片并干燥。 检测：显微镜下分别测量细胞从中心孔向样品孔游走的距离（趋化游走距离）及向阳性对照孔的游走距离（自发游走距离），趋化 活性以趋化指数表示。 趋化指数=趋化游走距离/自发游走距离 关键点 为确认待检样品中IL-8的特异性趋化效应，最好同时比较抗IL-8抗体与待测样品作用后的趋化结果。六、IL-10生物学活性检测在小鼠IL-4（Mil-4）存在的情况下，IL-10可刺激D36小鼠肥大细胞株增殖。而单一的m IL4或h IL-10则仅有很低的增殖刺激活性。试剂与材料（1） 20%FCS-IMDM培养液，含8U/ml的rm 里减四。 （2）rh IL-10标准品。 （3）3H-TdR。 （4）D36小鼠肥大细胞株。操作流程 D36细胞悬液制备 接种细胞于96孔培养板 加待测样品和标准品 加3H-TdR 收集细胞，测定3H-TdR掺入量 绘制标准曲线，计算待测样品的IL-10的活性单位 *注： 取生长旺盛的D36细胞用IMDM培养液洗涤2次，悬于20%FCS-IMDM培养液，并调制浓度为2104/ml。 参考IL-4测定。附 录一.几种营养液，缓冲液和试剂的配制110%NaHCO3溶液： 取NaHCO3 10克加蒸馏水100毫升，高压灭菌1.5磅/10分钟即可使用2Hanks液：原液甲 NaCl 160 克 KCl 8克 MgS