布鲁氏菌病实验研究及生物安全课件.ppt

布鲁氏菌病实验研究及生物安全ResearchProgressofBrucellosisinChinaandControlandPrevention 中国人间布鲁氏菌病疫情1950 2014年 中国人间布鲁氏菌病空间分布变化 中国家畜布鲁氏菌病疫情 2014年中国布鲁氏菌病疫情分布 中国人间布鲁氏菌病疫情 2012 2013 2014年布病病例报告分析 Amsterdam TheNetherlandswww kit nl 世界卫生组织建议的人布鲁氏菌病诊断 世卫组织建议的检测包括 虎红平板试验 RBT 血清凝集试验 SAT Coomb s试验补体结合试验 CFT ELISA荧光偏振布氏菌培养PCR世卫组织未具体确定流程 取舍值和检测特征 诊断灵敏性和特异性 没有明确的阳性和阴性预测值 PPV NPV 结论取舍值 及灵敏性 特异性 因抗原来源和流程差异而不同 有待优化PPV和NPV取决于疾病的流行程度 有待确立建议开展检测前 应在设计适当的环境中确定诊断功效 灵敏性 特异性 PPV和NPV等 WHO人布鲁氏菌病的诊断检测 IgM IgG侧向层析检测荧光偏振检测虎红平板试验血清凝集试验2 ME试验IgM IgGELISA库姆斯 IgG CFT培养 仅在BSL 3中 PCR 简易 快捷 复杂 要求高 灵敏性 参考 特异性 参考 保健点 参比实验室 诊断机构 Amsterdam TheNetherlandswww kit nl 虎红平板试验 检测特征 流行率低 灵敏度92 9 急性病例 特异性94 3 无暴露史 特异性91 7 重复暴露 特异性76 9 既往布病患者 Ruis MezaetalClinMicrobiolInfect 2005 11 3 221 5 不同来源 品牌 和批次的抗原质量差异很大难以解读 弱阳性 由于暴露和非特异性反应 在疾病流行地区的表现不良需要确定取舍值结论诊断功效在很大程度上取决于制剂来源和疾病流行程度 需要确定取舍值 血清凝集检测 1 401 801 1601 3201 6401 1280 发现凝集抗体 IgM和IgG 灵敏性随疾病持续时间下降顽固性和布病复发患者中表现不佳在本地流行地区 暴露个体中的特异性较低流行地区的建议取舍值为1 320 提高特异性导致的低灵敏度难以读取和标准化2 ME检测可用于确诊急性病 IgM的指示性滴度降低2倍或2倍以上 布氏菌可被碱性染料着色 如革兰染色为阴性 姬姆莎染色呈红色 布氏菌对染料吸收缓慢 布氏菌革兰染色 双相全血培养瓶 已接种 自动培养仪和培养瓶 布氏菌生化鉴定 血平皿布氏菌菌落 布氏琼脂布鲁氏菌菌落 布氏菌产生S2H试验 BCSP31 PCR 引物和扩增片段 产物223bpPrimer1 B45 TGGCTCGGTTGCCAATATCAA 3 Primer2 B55 CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG 3 检测BCSP31基因的PCR方法 可以在属的水平上检测和鉴定布鲁氏菌菌株OIE推荐鉴定布鲁氏菌种的方法之一 MDL2000DNALadder1 B melitensis2 B abortus3 B suis4 B ovis5 B neotomae6 B canis M123456 布鲁氏菌属BCSP31 PCR电泳结果 223bp AMOS PCR鉴定布氏菌种 布鲁氏菌DNA多态性一个原因就是插入序列分布 IS711就是一段插入序列 在数量和位置上都很保守 一个引物锚定在IS711上 其他不同的引物分别选在与插入基因IS711邻近的单染色体DNA上 代表种的特异性 通过扩增带的大小来鉴别种 设计5条引物的混合反应体系 适用于布鲁氏菌种间的鉴定方法 可鉴别布氏菌牛种1 2 4型 羊种布鲁氏菌 猪种1型和绵羊附睾种 除了共有的178bp以外牛种布鲁氏菌1 2 4型扩增条带为498bp 羊种布鲁氏菌扩增片段为731bp 猪种1型扩增条带为285bp 绵羊附睾种961bp 19株标准菌株AMOS PCR扩增结果 1 22 DL2000DNALadder2 4 B Melitensis1 35 11 B Abortus1 712 B Abortus913 17 B Suis 1 518 B ovis19 B neotomae20 B canis21 阴性对照 750bp500bp250bp M1234567891011 250bp223bp 布鲁氏菌属种鉴定 1 5AMOS扩增1 c 2 羊13 牛14 猪15 待检菌株6 10BCSP31 PCR 6 羊17 牛18 猪19 OVIS10 待检菌株 多重PCR Bruceladder EvaluationofaMultiplexPCRAssay Bruce ladder forMolecularTypingofAllBrucellaSpecies IncludingtheVaccineStrains B abortus B melitensis B suis B cains 布氏菌MLVA分型 中国分离株的基因型分布 生物安全 布氏菌在病原微生物的危害等级划分 2类属于高致病性实验室适用等级分类 BSL 3其中弱毒株或疫苗株可在BSL 2实验室操作小量标本 初代分离等可以在BSL 2实验室操作血清学检测可以在BSL 1实验室操作 1 布鲁氏菌强毒菌株 疫苗菌株 弱毒菌株均可能造成人体感染 感染所需菌量会有较大差别 2 实验活动与实验室级别要求布病血清学实验可以在BSL 1实验室进行未知标本分离菌 少量菌株实验 弱毒菌株的实验在BSL 2实验室进行布氏菌的抗原制备 菌种保存在BSL 3 生物安全 注 a大量活菌操作 实验操作涉及 大量 病原菌的制备 或易产生气溶胶的实验操作 如病原菌离心 冻干等 c样本检测 包括样本的病原菌分离纯化 药物敏感性实验 生化鉴定 免疫学实验 PCR核酸提取 涂片 显微观察等初步检测活动 d非感染性材料的实验 如不含致病性活菌材料的分子生物学 免疫学等实验 生物安全 病原微生物实验室感染分析实验室获得性感染 laboratory acquiredinfection 由于没有监测 报告系统 数据资料不全生物安全包括 实验室实践 实验室设计 个人防护措施和安全设备 生物安全 美国一份文件统计实验室感染43 由细菌 27 由病毒 15 由立克次体布氏菌是最常见的实验室获得性感染最多的操作是 动物攻毒试验 冻干菌种 强毒株的大量抗原制备等 生物安全 感染途径吸入 皮肤粘膜污染 摄入等吸入感染很多操作可产生气溶胶 如 感染动物的皮毛 粪便 烧接种环 抽真空 离心 搅拌 研磨等气溶胶 5um液滴核会悬浮于空中 皮肤粘膜污染 含病原体的液体溅在眼睛 口鼻粘膜及其他皮肤感染摄入感染 误食和不洗手吃食物接种感染 当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时 应进行危害程度评估 危害程度评估应至少包括下列内容 生物因子的种类 已知的 未知的或未知传染性的生物材料 来源 传染性 致病性 传播途径 在环境中的稳定性 感染剂量 浓度 动物实验数据 预防和治疗 危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行 生物安全的评估 生物安全设备 生物安全柜吸附垫 在操作台上放上贴有吸附材料的塑料薄膜 每日更换 可以把操作台的污染减少到最低程度 柜内实验器材和材料的取出 生物安全实验室的废弃的污染性材料 使用过的包装材料 容器 纸张等废弃物 都收装好或者经高压灭菌器灭菌后拿到缓冲区 实验中或完毕后 必须从安全柜中取出非灭活的病原体时 应装好放在消毒液槽中 使容器外侧被消毒后取出 消毒液种类因病原体不同而异 生物安全设备 回收容器 在安全柜内配置回收污染物质的容器 配置存放污染的玻璃器皿和废弃物容器 容器中必须配有消毒液 将污染物质完全浸没 这些回收容器至少每天操作完毕后盖好以防污染 再次使用时需重新清配置消毒液 瓶盖 安全柜内使用的瓶子不用橡胶塞 而用螺旋盖 开启时可减少气溶胶的发生 消毒火焰 用火焰消毒是经典的微生物学操作方法 但是由于会产生气溶胶 并顾虑使柜内气流紊乱 尽量不使用 良好的内务行为 应指定专人监督保持良好内务的行为 工作区应时刻保持整洁有序 禁止在工作场所存放可能导致阻碍和绊倒危险的大量物品 所有用于处理污染性材料的设备和工作表面在每班工作结束 有任何漏出或发生了其他污染时应使用适当的试剂清洁和消毒 对漏出的样本或培养物应在风险评估后清除并对涉及区域去污染 清除时应使用有效的安全预防措施 安全方法和个人防护装备 良好的内务行为 内务行为改变时应报告实验室负责人以确保避免发生无意识的风险或危险 实验室行为 工作习惯或材料改变可能对内务和 或维护人员有潜在危险时 应报告实验室负责人 并书面告知内务和维护人员的管理者 应制