葡萄中白藜芦醇的含量及功能研究.doc

成绩葡萄中白藜芦醇的含量及功能研究摘要：白藜芦醇在人体中有降血脂、防血栓、抗癌、抗氧化、抗菌和预防老年痴呆等多种生理功能。在植物中也是一种抗毒素。本文总结了葡萄不同品种及部位白藜芦醇的含量差异，并对影响白藜芦醇含量的影响因素进行了总结。关键词：葡萄 白藜芦醇 生理功能 含量差异 影响因素 白藜芦醇化学名称为芪三酚（Resveratrol，3,4,5-三羟基二苯乙烯），是植物界分布较广的羟基二苯乙烯芪类化合物，属于二苯乙烯衍生物。白藜芦醇有顺式和反式两种异构体。自然界中的白藜芦醇以游离态和化合态两种形式存在，化合态以糖苷和低聚物的形式存在，故白藜芦醇一般有4种存在形式：顺、反式白藜芦醇和顺、反式白藜芦醇糖苷。1 Res对人类疾病的药理作用 流行病学调查发现，长期适量饮用红葡萄酒能够降低心血管疾病的发病率和死亡率，其中的Res是主要的活性物质，并发挥了重要作用。近年来，国内外越来越多的研究表明，Res具有多种生物学效用。Res能与人体内雌性激素受体结合，调节血液中胆固醇水平，有效减少人罹患心血管病的危险2；Res还能抑制低密度脂蛋白过氧化和血小板凝集，调节脂类蛋白代谢水平，降低人体血脂，具有良好预防动脉粥样硬化和冠心病效果3-4。Res还具有强抗氧化和抗自由基功能，1.3 g/mL的白藜芦醇能明显抑制大鼠红细胞的自氧化溶血和由H2O2引起的氧化溶血，并对小鼠心、肝、脑、肾的体内外过氧化脂质的产生有明显抑制作用6。Res具有抗突变以及抗癌作用，能抑制环加氧酶和过氧化氢酶的活性，在癌细胞的起始、增殖、发展3个主要阶段均有抑制乃至逆转作用7；Res可使老鼠皮肤癌细胞最多可减少98%8，能诱导人早幼粒细胞性白血病细胞株HL-60的分化9，被喻为继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌药物。Res具有明显的辐射保护作用10，并影响骨骼代谢11等。Res衍生物piceatannol具有和Res相同的抗癌12、免疫调节、抗菌、抗脂质氧化和抗癌细胞增殖的活性13。此外，Res及其衍生物在肝脏保护、激活长寿基因、防治神经性疾病等方面也起着重要作用14。因此，Res广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域。2 葡萄Res对植物病害的抵抗作用 Res作为葡萄属植物的一种抗毒素被发现后，引起了科学家的高度重视。Langcake15等首次在葡萄叶片中发现Res，并能抵抗灰霉病（Botrytis cinerea）的侵染。Pont16等认为白黎芦醇抗灰霉病的活性与其亲脂性大小、分子体积及电子特性相关，并破坏细胞膜的结构，影响电子的有效传递。Hain17等将分离出的葡萄茎STS基因转到烟草中，结果发现这些烟草在受到病原菌感染时，感染部位有大量Res的积累，并且其合成Res能力与烟草抗灰霉病的能力呈正相关。郜海燕11等研究发现，葡萄在遭到霜霉菌（Plasmopara viticola）侵染后，在没有被侵染且离坏死果实较近的部位其白藜芦醇的含量较高，说明Res作为植物抗毒素可以有效地抑制坏死区的扩展。Dercks18等发现了17个葡萄品种对霜霉病的抗性与紫外线诱导产生Res的能力正相关。John19等研究发现，Res与抗真菌能力相关。从野生葡萄中提取的Res对金黄色葡萄球菌（Slaphylococcus aureus）、耻垢分支杆菌（Mycobaeteriam smegmatis）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）有较强的抑制作用，且大量报道葡萄中Res含量的高低与抗真菌能力有关20。Schnee21比较研究了不同葡萄品种对白粉菌（Erysiphe necator）的抗性，发现敏感品种感染病菌后产生的大量Res迅速糖基化为较小毒性的白藜芦醇苷（piceid，PD），而抗性品种感染病菌后产生的大量Res则迅速氧化为更高毒性的白藜芦醇聚合体（viniferins）。3葡萄Res含量研究葡萄不同品种间Res含量不同。国内外大量学者对葡萄组织中Res含量进行研究，结果发现葡萄各品种间Res含量存在较大差异。葡萄Res含量可能与生长环境、果实性状、用途等相关联，研究发现有核品种Res含量显著高于无核品种。李婷22等用HPLC法测定14个葡萄品种Res含量，结果表明：酿酒葡萄中的Res含量明显高于鲜食葡萄，供试葡萄品种中以黑比诺的Res含量相对较高。Li23等从种质资源水平上评价葡萄Res含量，结果发现种间杂交的砧木品种果皮和种子的Res含量显著高于其他栽培品种（美洲种欧亚种）。葡萄不同器官间Res含量也存在着显著差异。在正常生长状况下，葡萄果皮、种子含有较高的Res，果肉中很少，叶是检测Res最主要的器官，花和芽合成Res能力很低。谢红旗24等测定葡萄的生长器官的Res含量，结果表明：主藤侧藤支藤根叶片叶柄；各部位白藜芦醇在生长期含量变化趋势是先升后降，变化趋势较小。陈雷25等对葡萄果肉、叶柄、种子、叶片、果皮及穗轴的检测发现，果穗轴和果皮中的Res含量较高，叶片和种子中的含量相对较低，果肉部分最低，而李婷26等研究发现：Res含量为果梗、叶片果皮种子叶柄。赵权27等对山葡萄叶、茎、卷须、果实检测发现，卷须茎种子果皮果肉。叶中白藜芦醇含量最高，达20.12 g/g。邓建平等研究了成熟度与Res含量之间的关系，结果表明成熟果皮成熟叶茎段；成熟果皮嫩果皮；成熟叶老叶嫩叶。萄植植株某些器官之间Res含量存在着一定的相关性，研究结果表明：葡萄浆果中Res的含量与叶子中的含量呈正相关28。4葡萄中Res含量的影响因素4.1影响葡萄中Res含量的内在因素 Res是植物在受到病原形进攻和在环境恶化时产生的一种植物抗毒素29。真菌细胞壁碎片常被用在刺激葡萄发生灰霉病感染的某些过程，例如通过酸的水解作用，葡萄属植物细胞从真菌细胞壁中可得到葡聚糖激发子、可溶性碎片、可溶性片段可阻断常规蛋白的合成，而启动一小部分与诱导抗性有关的蛋白的合成，经过诱导被强化的葡萄属植物细胞在葡聚糖激发子、可溶性碎片共同作用下产生Res及其衍生物30，末尾阶段是Res合成酶（简称RS）将一分子的对香豆酰辅酶A（P-coumarogl)）和三分子的丙二酰辅酶A（malonyl-CoA），经苯丙氨酸聚丙二酸盐路径，转化为几种Res31。在Res的生物合成过程中有5种酶已被发现：合酶（简称STS），是人们研究最透彻的一种酶，STS的合成在整个Res的合成过程中速度是最快的，从空间角度来说，STS呈现微观的不均一性，是带一个亚基的二聚体，分子量为43000，等电点RI=5.432。进一步研究发现它是负责酚类形成及Res合成的，整段的STS的cDNA是从葡萄属植物的mRNA序列开始的，含有39种氨基酸的片段，用PSV25作载体片段再分别插入到载体PKK233-2和PDS12/RBSH-2所得到的cDNA基因库在大肠杆菌中的表达产生了一个单独展示STS活性的二聚体33-34。通过对臭氧在欧亚种葡萄品种上诱导STS转录表达的研究（此研究是通过溶合TST启动子与-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因，再转化到烟草上），发现0.1mg/L臭氧处理10h可以使GUS基因表达提高11倍，GUS基因活性组织化学定位发现其活性表达呈斑点状分布于整个叶片。叶片的横切面组织化学定位表明STS的启动子（Vst1）在栅栏组织、海绵薄壁组织中被诱导，表皮组织细胞中表达较少。5端缺失表明部分启动序列在-430和-280处构建臭氧反应作用区，有效病原菌灰霉病诱导应从-280到-14035。Reniero等36从葡萄栽培品种霞多丽（Chardor-nay）的根中分离到Res的二聚体。Pool37等测试了15种葡萄成熟节间的木质部，发现其Res的含量不同。叶是检测Res使用最多、最方便的器官。芽和花合成Res的能力较低。果皮、果穗轴中含有较高的Res，尤其是果穗轴中，含量更可观，可达81.37mgg-138，是人类未来从饮食中摄取Res的主要源泉。青铜色和黑色果皮的圆叶葡萄，种子和果实与其它部分相比，Res的含量约占总量的23.430.1%。果实的果肉部分Res的含量很低，有些品种根本就不含Res39-40。葡萄植株某些器官之间Res含量存在着一定的相关性。研究结果表明：葡萄浆果中Res的含量与叶子中的含量呈正相关41。葡萄植物仅在适当的时期才合成Res，并且能合成的时期较短暂。Res无论是否产生抗病作用，其含量都将呈下降趋势42。Dercks等43调查了对霜霉病呈抗性、中抗、感病3个类型的不同品种，认为抗病品种卡斯特在霜霉病发病期可以一直保持较高的水平；抗病中等的Rupestris6544接种病菌后的最初几个小时积累一定量的Res，但积累水平很快下降；感病品种雷斯令一直呈下降趋势。Res的明显动态变化期出现在果实成熟期，其含量下降很快44-45。Jeandet46调查了葡萄栽培品种黑比诺（Pinot noir），认为Res的含量是易变的。黑比诺与美洲葡萄（labrusca）浆果的Res含量在着色期后一直下降，黑比诺最后几乎接近于零。Res在果皮中的含量与果实成熟过程中糖的含量呈负相关47。Jeandet等48的研究认为，Res在果实成熟期骤然下降，这种源于葡萄不同生长期和花青素苷的消长关系，Res的前体为苯基苯乙烯酮，而此物的合成需要一种酶，这种酶又是花青素苷合成的关键酶，两种合成相抗争的结果，出现了Res合成能力的下降伴随着一系列花青素苷物质的升高。4.2影响葡萄中Res的外在因素4.2.1紫外线（UV） 紫外线照射是Res产生的必要外部因素之一。紫外线最高峰值为260270nm时可有效诱导Res的产生。用通量率为1W/m2的UV（270nm）照射10min，4h后Res的合成酶活性达到最大，在低通量率照射下，合成酶达到最大活性时所需时间加长49，254nm以下的UV对Res有破坏作用。在照以高强度的UV时，溶于乙醇中的tras-Res能转变为cis-Res50。4.2.2温度、湿度 生长在湿热条件下的葡萄比生长在气候寒冷、干燥条件下的葡萄，由于病害侵染的压力较大，果实中所含的Res也较高51。4.2.3病菌侵染胁迫 研究认为52，对每个栽培品种来说，增加菌种的密度都会导致Res合成能力的提高。10.2.4机械损伤 果皮的机械损伤导致正常浆果合成Res能力下降。4.2.5杀菌剂 Dercks等53在葡萄霜霉病方面研究了杀菌剂（Fosetyl）对Res的积累的影响，此研究包括两个内容，是否需接种病菌孢子及FosetyL-A1的使用时期。结论指出，接种与FosetyL-A1的使用，两种选择压力结合起来比单独用FosetyL-A1效果好；接种后使用FosetyL-A1可使Res的含量增加几倍。4.2.6化学元素、化合物使用粘酸（Mucic acid）可诱导Res的产生54；Coulmb-C等89在葡萄成熟后一天，喷布波尔多液和氢氧化铜，通过样品生化分析表明，浆果防御机能的综合指标提高，这些指标包括过氧化氢、酚、Res、花色素，得出铜可以帮助激发植物固有防御机能的结论。5展望 Res不仅能够提高植物的抗病性，还具有多种生物活性和药理作用，有着广泛的研究和应用前景。提出几点今后的研究方向：（1）研究葡萄的种质，确定高Res含量基因型葡萄遗传规律，获得高含量Res葡萄新品种。运用现代分子技术以及遗传育种等手段深入研究葡萄种质，特别是野生葡萄种质Res含量特点及遗传规律，确定高Res含量基因型葡萄，通过遗传育种获得高含量Res葡萄新品种，以此来获取纯天然的Res。（2）Res抗病机理的研究。目前对于抗Res病机理研究尚不成熟，主要缺乏有效的工具来确定Res及其衍生物在植物细胞和组织中的转运/运输机制，因此对于Res及其衍生物在植物抗病中所起的作用很难评估。（3）由于不同的处理使得葡萄中白藜芦醇含量发生变化，因此可通过一定手段提高葡萄中白藜芦醇的含量。参考文献1 李景明， 倪元颖， 蔡同一，等.发酵工艺条件对葡萄酒中白藜芦醇的影响J.工艺技术，2004，25（4）：113-1142任彦荣,吴洪斌. 白藜芦醇的检测手段及药理作用J. 安徽农业科学, 2012, 40(2): 788-7903Zou J, Huang Y, Chen Q, et al. 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