Southern步骤.doc

Southern杂交采用Roche 公司高辛标记试剂盒进行探针标记并进行Southern DNA分子杂交。1.基因组的提取：（用SDS-CTAB法提取基因组，并测定OD值）取2l于0.8%琼脂糖凝胶中，100V，电泳30min，拍照，其余置-20保存或直接用于酶切。2.酶切及电泳1)酶切反应体系配制： 基因组 150200 mg 10限制酶缓冲液 50 ml 限制性内切酶 200 U 灭菌水 至总体积500 ml 混匀体系，37过夜酶切。2)酶切产物电泳：将酶切产物沉淀下来，并用50ul水溶解沉淀。制备0.8%琼脂糖凝胶，加5ml 10loading buffer到50ml 的酶切消化产物中，上样并电泳，35V电泳过夜。3.转膜(1) 将凝胶加样孔及不含样品的多余部分切掉，置于0.25M HCl中浸泡10分钟； (2) 用蒸馏水稍冲洗后，浸于变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中室温变性，15分钟2次共30分钟，其间轻摇数次； (3) 用蒸馏水稍冲洗后，浸于中和液(0.5M TrisCl，pH7.4，1.5M NaCl)中于室温中和15分钟2次共30分钟，其间轻摇数次； (4) 洗净转膜仪，选窗口大小合适的封闭膜，剪一张略大于凝胶块的滤纸及尼龙膜，蒸馏水浸润后置于20SSC中至少5分钟，剪去一角与凝胶块对应铺于底部，后将封闭膜压好，然后将凝胶铺在窗口的尼龙膜上，赶除气泡； (5) 真空转移，20SSC中性转移缓冲液真空转移1.5-2小时，压力5 inch Hg；4.固定DNA： 用UV交联仪（UPVL1000）将DNA固定在膜上5.探针的标记：探针可以提前制备好，冻存。根据Roce公司的DIG标记试剂盒进行如下操作：（所用PCR仪 Thermo Electron PxE基本型PCR仪） 在25l反应体系中加入2.5l 10PCR buffer（MBI），2.5l 10PCR DIG DNA labeling Mix（Roce），25pmol上游引物，25pmol下游引物，0.5lTaq（MBI），50pg模板DNA，同时用未标记DIG的dNTP(MBI )作对照反应。反应条件根据不同的模板稍有变动。反应结束后电泳检测标记效率，标记后的探针应比没有标记的产物分子量大，-20冻存备用。6.杂交与检测（NBT/BCIP显色）：(1) 将固定好的尼龙膜放于预杂交液中(10ml/100cm2膜)，在杂交炉（Fisher分子杂交箱）中65保温4小时；(2) 弃去预杂交液，按2.5ml/100cm2膜的量加入杂交液，杂交液中含DIG标记的探针（2l DIG探针/1ml杂交液），65杂交16小时；(3) 倒出杂交液，杂交液中含有未杂交的探针，放到-20度备用（4）用2SSC，0.1% SDS溶液洗膜25分钟； (5) 用0.1SSC，0.1% SDS溶液洗膜215分钟；（6）在杂交和严谨洗涤后，将膜置洗涤缓冲液浸润15min。（7）2030ml 封闭液孵育 30min； （8）取anti-DIG-AP（Roce），按1:5000稀释于封闭液中，取20ml该溶液浸泡尼龙膜，室温孵育30分钟；（9）用2030ml洗涤液洗涤215min；（10）15ml 检测液中平衡25min； （11）显色：现配20ml 显色底物（NBT/BCIP） 暗处静置显色；（12）50ml灭菌水或TE洗膜5min终止显色，拍照保存，将膜封存于装有TE的塑料袋中，可长期保存。所涉及溶液的配制： 变性液 0.5mol/L NaOH 1.5 mol/L NaCl 中和液 0.5 mol/L Tris-HCl 3 mol/L NaCl 漂洗液Washing Buffer（pH 7.5）： 0.1mol/L Maleic acid（马来酸） 0.15mol/L NaCl 0.3 %（v/v） Tween20 马来酸Buffer Maleic acid Buffer（pH 7.5）： 0.1mol/L Maleic acid 0.15mol/L NaCl 检测液Detection Buffer（pH 9.5）： 0.1mol/L Tris-Cl 0.1mol/L Nacl TE-buffer（pH 8.0）： 10mmol/L Tris-Cl 1mmol/L EDTA 20SSC（pH 7.0）： 3.0mol/L NaCl 0.3mol/L 柠檬酸钠 封闭液：1working solution 由10Blocking solution（试剂盒提供）用Maleic acid Buffer稀释。 抗体溶液：Anti-Digoxige