微生物遗传学复习资料一.doc

绪论和一章 1 分离法则：一对基因在形成配子时完全按照原样分离到不同的配子中去，相互不发生影响。 2自由组合定律：在配子形成时各对等位基因彼此分离后，独立自由地组合到配子中。3微生物作为遗传学研究材料的特点：单细胞或多细胞不分化的低等生物，病毒无细胞结构，适宜于作为遗传研究材料； 原核微生物一般为单倍体，许多真核微生物的营养体也是单倍体，不存在显性与隐形基因问题； 绝大多数微生物均能在人工培养基上生长繁殖； 代谢作用强，在培养基上积累大量代谢产物有利于基因表达的研究； 生长繁殖迅速，有利于缩短研究周期。4作为遗传材料的优越性： 易于筛选到营养缺陷型。在基本和加富培养基上进行影印培养； 便于作为基因突变的研究材料； 便于作为基因重组的研究材料，利用营养缺陷或抗药性标记； 便于用作研究基因结构、功能和调控机制的研究材料； 揭示一切生物基因的遗传规律； 以微生物为载体，进行遗传工程研究。5、经典遗传学的建立和发展（奥）孟德尔（mendel，1822-1884）：经典遗传学之父，以豌豆为杂交材料于1865年发表植物杂交的试验一文。首次提出植物的遗传性状是由遗传因子决定的假说，即孟德尔定律（遗传因子的分离定律和自由组合定律）。约翰逊（Johnson，丹麦）：提议用基因（gene）一词来表示孟德尔的遗传因子。摩尔根（Morgan，1866-1954，美）：以果蝇为材料，发现果蝇的基因分离存在连锁现象，提出了遗传的染色体学说，认为染色体是遗传的物质基础，基因在染色体上呈线性排列。麦克林托克（McClintock）：1931年首次在光镜下观察玉米基因重组时染色体内部或之间发生断裂和重组过程，还发现跳动基因（插入因子）存在。华生（Watson）和克里克（Crick）：1953年提出了DNA分子结构的双螺旋模型。格里菲思（Griffith，1928，英）：首次发现肺炎双球菌的转化（transformation）现象。比德尔（Beadle）和塔特姆（Tatum）：1941年以粗糙脉饱菌（Neurospara crassa）为材料，用X射线诱变筛选获得营养缺陷型（auxotroph）突变株，均不能在基本培养基上生长，提出一个基因一种酶的假说。卢里亚（Luria）和德尔布鲁克（Delbruck）：1943年进行了著名的波动分析试验（fluctuation analysis），证明细菌对噬菌体产生的抗性突变是自发产生的，与他们是否同噬菌体接触无关。 其结果随后又被纽可布（Newcombe，1949）用涂布试验（respreading exeperiment）和莱德伯格（Lederberg，1952）用影印培养法（replica-plated incubation）进一步验证：细菌的基因突变发生在它们与噬菌体或药物接触之前，后者仅作为一种筛选手段，将自发产生的抗性突变从大量的突变中筛选出来。莱德伯格（1946）和戴维斯（Davis）：揭示了与转化作用不同的细菌基因重组方式二接合作用（conjugation）。 以E.coli K12两种营养缺陷型混合培养获得基本培养基上生长的野生型 （wild type）菌株。莱德伯格和津德（Zinder）：1951年发现细菌重组方式三转导作用（transduction）。 鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型LT2和LT22A分别培养在微孔过滤板隔开的U型管两端，数小时后在LT22A一端可检测到野生型细胞；受体菌LT22A释放的噬菌体P22导致了基因从供体菌向受体菌转移。梅塞尔逊（Meselson）和斯塔尔（Stahl）：1958年用15N和14N交换培养E.coli，证明了DNA的半保留复制方式。雅各布和蒙洛德（Monod）：1961年提出了“操纵子”学说：E.coli乳糖调节机制: DNA上有结构基因和调节基因。霍利（Holley）、柯雷拉（Khorana）和尼雷伯格（Nirenberg）：1965年证明由DNA转录的mRNA上三联遗传密码的存在，揭示DNA与蛋白质合成的关系。阿贝（Arber），史密斯（Smith）和纳萨斯（Nathans）：1972年从微生物中提取出限制性内切酶，为基因工程创造条件。6原核微生物：细菌、放线菌、蓝细菌 单倍体：一个细胞只有一条染色体或一套基因组 环状双链DNA不与组蛋白相结合7真核生物和原核生物基因转录和翻译的区别： (1).原核生物基因转录和翻译同时进行 (2.)真核生物包括： 细胞核内染色体DNA上基因的转录，初级转录物的加工，成熟mRNA由核内经核膜转运到细胞质，与细胞质中的核糖体相结合翻译出蛋白质并对其进行初加工，最后再由内质网或高尔基体等在转运过程中进行修饰加工才能产生出有功能的蛋白质。8原核生物遗传物质主要构型：双链环状DNA并且不与组蛋白相结合。9 E.coli染色体有一条，是单倍体分子量是2700MD长度为1100nm大约含4000多个基因。10 谷草芽孢杆菌分子量2000MD到2800MD复制双向控制，它的基因有42个。11 放线菌代表菌株为天蓝色链霉菌，染色体DNA为环状12 原核微生物染色体以外遗传物质是质粒，它的存在染色体外独立复制的遗传物质，为分子量较小的共价闭合环状双链DNA， 存在于细菌和放线菌中 控制宿主生物的次要性状（如抗药性、接合作用、降解能力、产细菌素和固氮作用等）； 质粒赋予宿主细胞新的特性，消除质粒不会影响宿主细胞生存； 细胞分裂时，质粒能独立复制并均匀分布到子细胞中。13 动物病毒：DNA型：如痘病毒（poxvirus）RNA型：如流感病毒（influenza virus植物病毒：多为RNA病毒，如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus）；少数为DNA病毒，如花椰菜花叶病毒（cauliflower mosaic virus）噬菌体：细菌病毒，多属DNA型，如大肠杆菌T系列，、X174; 少数RNA型，如f2等14 病毒的核酸类型DNA双链（常见）RNA单链（常见）DNA单链：如X174RNA双链：如呼肠孤病毒病毒的结构：大多病毒核酸：线状开放式类型，进入宿主细胞后转为环状（具特殊末端重复序列）少数病毒的核酸（主要是DNA）为闭合环状结构，如花椰菜花叶病毒不同类型病毒和噬菌体的核酸含量差异很大，某些RNA病毒（如呼肠孤病毒和水稻矮化病毒）中还存在多组份基因组（segmented genome）现象，这是RNA病毒所特有的。 T4属双链DNA M13 X174单链DNAMS2：单链（+）RNA，既是复制时的模板，又可直接作为mRNA翻译产生蛋白质 。 M13：环状单链DNA，丝状，不裂解宿主细胞 X174：环状单链DNA，重叠基因 T4：线状双链DNA 有趣现象：T4基因组中胞嘧啶被5-羟甲基胞嘧啶（hmc）取代，以避开寄主细限制修饰作用和保护自己的DNA不被降解。：温和噬菌体 线状双链DNA 15 真核微生物：双链DNA，主要存在于细胞核内的染色质中。主要有真菌如酵母菌 藻类如绿藻 原生动物等。16真核生物的染色体是一条由线状DNA双链和5种蛋白质组成的直径为10nm的串珠状丝。 第二章 一 基因命名规则每个基因座位用斜体或带下横线小写的三个英文字母表示（取自该基因特性的英文单词前三个字母）产生同一表型的不同基因，在三个字母后用不同大写英文字母表示。同一基因的不同突变位点，基因符号后加阿拉伯数字：染色体缺失时用表示，如(Lac、Pro)，Lac：乳糖发解基因表示质粒的符号应避免与染色体基因符号相同。二 基因突变的类型l 以突变发生的方式分：基因突变自发突变诱发突变l 以突变引起的表型变化分：形态突变生理生化突变抗生突变致病性变突l 以引起突变的遗传物质变化分：碱基置换移码突变l 以突变对遗传密码的影响分：同义突变错义突变无义突变三 基因突变的规律1随机性基因突变的发生从时间、个体、位点和所产生的表型变化等方面都带有明显的随机性。突变的发生（如抗药性）与微生物所接触的环境条件（药物存在如否）无关。2独立性基因突变独立发生的，某一个基因的突变与另一基因的突变是在不相关的独立事体。3稳定性基因突变是遗传物质发生改变，突型型基因具有相对稳定的结构，是可以遗传的。4可逆性基因突变具有可逆性。5、稀有性：自发突变频率很低：10-910-5之间。四、突变率的计算方法突变率：每一个细胞在每一个世代中发生突变的机率，也是突变在每一个细胞生存的单位生物学时间由发生的概率。突变频度：表示一定数目的野生型细胞中出现的突变型的数目，没有涉及世代这一生物学时间单位。N1、N2：代表t1、t2两个时间的细菌总数M1、M2：代表t1、t2两个时间出现的抗性菌落数纯系的突变率：M1=0 液体培养突变率：（应考虑细菌分裂次数g） 泊桑分布的零项为： P0：代表不含任何突变型细菌的样品的比数 N：每一个培养试管中的细胞数所以：突变型菌株在表型上的变化是基因突变的结果（细胞内DNA分子中碱基结构或顺序发生改变），自发突变率很低，微生物育种中常利用外界诱变因子（辐射、化学诱变剂等）诱发DNA结构改变。诱发突变：经诱变因子处理而提高诱变率的方法，包括化学诱变和物理诱变。五 化学诱变的种类及作用机制1碱基类似物引起的诱变l 碱基类似物：指在分子结构上与DNA中的碱基非常相似的一类化合物。DNA复制过程中，如果碱基类似物替代了正常的天然碱基掺入到DNA链中，将会引起配对错而发生诱变。如：5-BU（5 溴尿嘧啶）与T（胸脉嘧啶）结构相似，Z-AP（Z-氨基嘌呤）分子结构与A（腺嘌呤）相似： Z-APT配对（频率较高） Z-APC配对 Z-AP与T和C的配对关系六 与DNA直接起化学反应而改变其结构的诱变 化学诱变剂（亚硝酸HNO2、羟胺NH2OH、烷化剂），通过化学反应直接改变核酸的结构而发挥诱变作用。亚硝酸：通过氧化脱氨基作用把氨基转变为酮基，使CU，AH（次黄嘌呤），造成 UA和HC碱基错配，诱发GCAT及ATGC的变化羟胺：专一作用于C，并使之转变为能与A配对的形式（CA），从而引起GCAT突变。烷化剂：指在正常生理条件下，能将其烷基转移给重要的生物大分子的一类化合物。如甲基磺酸乙酯将烷基加到G和T的与氢键相结合的氧原子后，将会引起G和T的错配，从而引起ATGC和GCAT的转换。 七插入DNA分子结构的化合物的诱变移码突变 移码突变：DNA分子中一对或少数几对核基酸的增加或缺失造成的突变。吖啶类化合物（原黄素、吖啶橙、ICR-191）扁平分子结构，能插入到DNA的碱基对之间，是有效的移码诱变剂。八 物理诱变的种类及作用机制物理诱变因素多属辐射诱变。依性质分：电磁辐射：紫外线、X射线、Y射线粒子辐射：射线、射线、快中子和质子物理诱变依辐射产生的电离作用分电离辐射：X射线、Y射线、快中子非电离辐射：紫外线物理诱变九 辐射的生物学效应高能辐射能引起生物系统的损伤，辐射作用过程分为物理、物理-化学、化学和生物学等四个时相阶段,最终导致生物体的遗传变异。DNA经辐射处理后引起的反应：单核苷酸的受击，释放出磷酸酯和碱基；碱基受损，发生脱氨，分子结构开环或形成过氧化物脱氧核糖分子的羟基发生氧化或碳-磷键断裂DNA主链发生单链或双链断裂形成胸腺嘧啶二聚体（）DNA各分子间交联（单链内或两单链之间及DNA单链与染色体内的组蛋白之间）十紫外线（UV）诱变的分子机理200-300nm波长对诱导有效，波长254nm的UV最易被碱基所吸收，诱变效果最强。方法：波长253.7nm的15W紫射灯管，距离选择在28-30cm，3-5min多数微生物细胞死亡，灭活芽胞则需10min以上。UV诱变的生物学效应：直接作用于DNA而引起遗传物质改变。DNA断裂DNA分子双链的关联胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）的水合作用。形成嘧啶二聚体（）：主要损伤作用。导致基因突变的机制：两条DNA链之间的会阻碍双链的解链与复制，同一条链上相邻的T之间的二聚体会阻碍碱基正常配对，DNA复制终止或新链上出现错误的碱基序列，引起突变。十一高温引起的突变： 高温带来的能量能通过胞嘧啶（C）的脱氨基作用将其转换成尿嘧啶，从而使GCAT，引起突变。自发突变：未经诱变处理而出现的突变自发突变学说的证实三个经典试验十二波动实验（fluctuation test）结果：同一培养物（大试管）抗性（抗噬菌体）菌落数比较接近，不同培养物（20支小试管）样品抗性菌落数相差很大。分析： 如果抗性细菌的产生与噬菌体的存在有关，则20支小试管取样所得结果应当相近，可事实相反。事实上，抗性细菌的产生是由于自发突变的结果，由于突变在时间上的随机性，不同试管中的抗性细菌数将会表现高度波动。十三涂布试验（plate spread test） 方法：将5104敏感细菌细胞涂布在12个平板上，培养一定时间，半数培养皿直接喷上噬菌体，另外半数培养皿重新涂布后再喷噬菌体，继续培养，统计各皿出现菌落数。结果：抗性菌落数：重新涂布的培养皿大于未经涂布的培养皿，且在数量上有较大的波动。重新涂布前培养的时间越长，差异越大。分析：抗性突变的发生与接触噬菌体与否无关，突变在时间上是随机的自发突变。十四影印培养（replica plating）：自发突变学说证据：间接证据：波动试验，涂布试验。直接证据：影印培养结论：微生物自发突变的发生与噬菌体或药物存在与否无关，药物和噬菌体仅仅作为筛选自发突变的选择手段。十五、自发突变的作用机制：基因突变的本质：突变不论是自然发生的，还是诱发产生的，都是通过理化因子作用于DNA，使其结构发生变化并最终改变遗传性状的过程。自发突变与诱变的区别：自发突变：是受自然条件下存在的未知理化因子作用产生的突变；诱变：是人为地选择某些强烈影响DNA结构的诱变剂处理所产生的突变。诱变所产生的突变频率和变异幅度都显著高于自发突变。十六 自发突变的原因：1互变异构和环出效应 因DNA互变异构而产生的各种碱基错配DNA分子的四种碱基：T、G：可以以酮式（平衡倾向）或烯醇式状态存在。A、C：可以以氨基式（平衡倾向）或亚氨基式状态存在。通常：DNA双链结构中以AT和GC（酮式、氨基式）配对为主。异常：A=Ci（亚氨基式）、Ge（烯醇式）=T 、 Ai（亚氨基式）=As（氨基式） G=Te（烯醇式）、Ai（亚氨基式）=C等DNA除了碱基酮式烯醇式互变和氨基式亚氨基式互变以外，还存在正(sym)反(anti)的互变。酮式烯醇式互变或氨基式亚氨基式互变可以引起转换。正式反式互变可以引起颠换。DNA复制过程中的环出效应也是导致自发突变的另一个因素：自然状态下，偶尔也会因个别碱基对的局部解离和错误退火而导致环状突变，引起移码突变。十七微生物自身所产生的诱变物质的作用： 微生物自身代谢产生的一些化合物：如硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸及过氧化氢等具有诱变作用。由微生物自身所携带的转座遗传因子的转移和插入所造成的突变，也是广义的自发突变的一种原因。十八背景辐射和环境诱变：广义的自发突变。突变热点：指DNA链中具有很高突变率的碱基位点，突变率远高于一般位点。除同一基因内部的不同位点之间存在明显的突变率差异外，在同一种生物中的不同基因之间也表现出很大的突变差异。转座遗传因子：存在于细胞内，位于染色体或质粒上的一段特殊、可移动的DNA序列。转座：转座遗传因子改变位置的行为称转座。转座及效应：转座过程中，转座遗传因子作为一个独立的、不与其它DNA序列交换的单元，可从染色体上的一位置转移到另一个位置，或者从质核转移到染色体上。转座过程中，当转座遗传因子插入某一基因时，可使这一基因内的核酸序列发生改变而失活，从而引起突变。插入序列：(insertion sequence, IS因子)：是一段较短的DNA片段。IS因子大小一般在0.71.8kb之间。IS因子只含有与转座有关的基因和序列，它既可以单独、也可作为其它转座遗传因子的一部分存在于染色体或质粒上。IS因子结构特征：其序列的两端具有反向重复序列，在转座过程中它们是转座的识别位点。每种IS因子中均含有一个或几个编码多肽的区段，它们编码产生的蛋白质与转座及其调节功能有关。转座子（transposon,Tn）：又称易位子，除含有与转座有关的基因和末端反向或顺向重复序列外，中间还带有一个或几个结构基因（如抗性基因和转座酶基因等）。共整合体：当带有两个质粒（其中一个质粒含Tn3）的细胞经过一段时间培养后，可以以10-7的机率发现两个质粒融合成的中间体，称共整合体。转座机制模型的特点： 转座子在转移之前先进行复制，因此供体原来位点上的转座子一般不因发生转座而丢失。转座过程中先出现共整合体。在受体的新整合处出现靶序列。转座子具有内部解离位点或依赖同源的交换点。转座效应：插入突变效应。赋予受体菌新的抗药性而利于转座突变株的筛选。转座子使受体菌基因组发生缺失、重复、易位或倒位等DNA的重排 转座噬菌体：是一类具转座功能的可引起突变的溶源性噬菌体，不论是进入裂解循环还是处于溶源状态，均可整合到寄主染色体上。与IS因子、转座子(Tn)比较，转座噬菌体Mu有两个特点： 它不是细菌基因组的正常组分，因而易于识别。它可经诱导产生，易于制备。#微生物细胞内存在一系列修复系统，DNA分子某一结构的改变或损伤（即前突变），并不一定会导致真正的突变。DNA损伤的修复细胞多种酶共同作用的结果。光复活作用：紫外线照射后在DNA链上形成胸腺嘧啶二聚体（），在可见光（入300-600nm）照射下，经细胞内的光复活酶识别和作用，利用光量子所提供的能量，将二聚体内的环丁酰环打开而完成的修复过程。切补修复：通过一系列修复酶的协同作用，先将DNA的损伤部位切除，再进行修补复制的过程。常见的DNA损伤：脱嘌吟造成的碱基错配。脱氨基的C和A。重组修复：是在DNA复制的情况下进行的修复作用。重组修复过程：含或其它结构损伤的DNA进行复制(子代DNA链在损伤的对应部位留下缺口)。在细胞内重组蛋白的作用下，进行DNA分子间的重组，即从原来完整的母链上将相应的碱基序列转移至子链的空缺处。母链中失去的部分，再在DNA聚合酶的作用下，以其对应子链为模板合成单链DNA来填补。最后，在连接酶的作用下，以磷酸二酯链连接新、旧链完成重组修复过程。SOS修复：是在DNA分子受到较大范围的损伤，复制又受到抑制时，经诱导产生的种应急反应。SOS两条修复途径：1、增加细胞内原有修复酶的合成量。2、诱导产生新的修复酶系统又称倾向错误的修复或易误修复。某些理化因子引起细胞内DNA分子大片段损伤细胞原有的DNA聚合酶所催化的DNA复制过程进行到损伤部位时便受到抑制此时，可在细胞内诱导产生一种新的DNA聚合酶继续催化损伤部位DNA的修复合成。缺点：新的修复酶（SOS聚合酶，或错误倾向的DNA聚合酶）识别碱基的精确度较低，易造成修复过程中碱基配对的错误而导致基因的突变。SOS聚合酶以增加突变率为代价来提高细胞的存活率，原有的损伤不仅保留下来，而且增加了错误的碱基对，导致细胞的突变率增加。E.coli经低浓度的亚硝基胍（NTG）长时间处理后，可在菌体内诱导产生一种适应性修复蛋白，这种修复蛋白可以修复DNA上因烷基化而产生的损伤。适应性修复：把细菌因适应而产生的修复酶的修复作用称为适应性修复。六、修复与突变形成的关系突变形成的过程：造成前突变突变突变型表现过去认为：修复过程的作用是阻碍突变发生。现在观点：相当一部分诱变剂是通过启动具有高度错误倾向的修复体系而发挥诱变效能的。细胞内修复系统：校正错误（无误）修复：光复活作用、适应性修复。 引起错误（易误）修复：切补修复、重组修复、Sos基因重组：指来自两种不同采本的DNA分子在同一生物体内经过变换作用而产生新的重组DNA分子的现象。重组DNA能将其所得到的遗传基因遗传给它的后代。基因重组方式：区别：真核生物：基因重组通过典型的有性生殖方式有规律地进行。原核生物（细菌、放线菌等）：基因重组只能以转化、接合和转导的方式由供体菌（doner）进入受体菌（recipient）而形成重组子。一、转化作用的发现：1928年，格里菲思（griffith）在进行肺类双球菌的研究中心发现的。肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae，也叫肺类链球菌），一种致病菌。野生型（S型）：能产类膜、有毒力、菌落光滑，属于光谱型（smooth）突变型（粗糙型、R型）：不产生荚膜、无毒力。菌落粗糙，属于粗糙型（rough）。混合培养Griffith发现： （加热杀死）S型菌株+（活的）R型菌株 分离出活的S型菌，并能继续传代。1944年，艾弗里（Avery）等鉴定：从S型菌的细胞物质中抽损并纯化出转化因子，证明是DNA（用多种蛋白水解酶处理不影响转化结果，但如用脱氧核糖核酸酶处理则转化现象即刻消失）。二、转化作用的过程转化过程包括：感受态的出现，转化因子的吸附与渗入、转化因子的整合三个阶段。1、感受态的出现感受态（competence）：细菌能从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态。不同细菌的感受态出现的时间不同，肺炎双球菌和枯草杆菌出现在对数生长感受态的人工诱导：把供试细菌由营养丰富的培养液转移到贫乏的培养液中，或利用Cn2+和改变温度的方法，以利于外源DNA进入受体细胞。不同感受态时间细胞的转化率不相同，如处于感受态高峰的细胞可以不处于感受态的细胞转化率高出上百倍感受态出现的机制：局部原生质化假说：细胞表面的细胞壁是阻碍转化因子进入细胞的障碍，受体细胞的局部失去细胞壁或是细胞壁局部解体，DNA就能通过细胞膜而进入细胞。酶受体假说：认为感受态细胞表面能出现一种与DNA有结合能力的位点，转化因子首先必须与细胞表面的位点结合才能进入细胞，这种结合是受一种酶的作用而产生的。从肺炎双球菌、枯草杆菌、链球菌等细菌感受态细胞中提取到感受态因子分子量为5-10KD的蛋白质（可诱发非感受态细胞转化为感受态）。2、转化因子的吸附与渗入转化因子进入受体细菌首先必须先吸附在感受态细胞表面，然后再吸收到细胞中去。肺炎链球菌中两种转化缺陷型的部分特性转化因子进入受体细胞首先必须经过表面吸附阶段，即摄入的DNA集中在细胞表面的凹陷处。吸附和渗入过程中，细胞表面有两种核酸硝起作用：一种存在于细胞壁上，结合在细胞外的DNA在细胞壁上的核酸内切酶作用下，随机切成4-5MD长短的片段，然后再经细胞膜上的另一种核酸酶作用把双链中的一股解链而推动另一股进入细胞。3、转化因子的整合转化过程中，DNA在进入细胞前应以双链的形式结合在细胞表面，尔后才单跑渗入到细胞中，刚进入受体细胞而未整合之前的转化因子单链DNA分子没有转化功能，只有单链复制成双链后才有转化功能。转化过程：DNA吸附单链DNA浸入单链DNA进入受体细胞后，使受体DNA具同源性的部分双螺旋松开，供体和受体DNA单链的互补碱基配对。通过染色体更换使供体DNA整合于受体染色体上，与之配对的受体单链DNA则被DNA则被DNA酶分解。供体单链复制成双链，受体DNA不配对的另一链被切下并分解。三、转化的遗传分析转化DNA分子一般应超过一定分子量（10MD），约含15个以上的基因，每次转化时，一般受体菌株只能得到供体细菌的某一性状 第三章基因重组：指来自两种不同亲本的DNA分子在同一生物体内经过变换作用而产生新的重组DNA分子的现象。重组DNA能将其所得到的遗传基因遗传给它的后代。基因重组方式：真核生物：基因重组通过典型的有性生殖方式有规律地进行。原核生物（细菌、放线菌等）：基因重组只能以转化、接合和转导的方式由供体菌（doner）进入受体菌（recipient）而形成重组子。从肺炎双球菌、枯草杆菌、链球菌等细菌感受态细胞中提取到感受态因子分子量为5-10KD的蛋白质（可诱发非感受态细胞转化为感受态）。转化的遗传分析转化DNA分子一般应超过一定分子量（10MD），约含15个以上的基因，每次转化时，一般受体菌株只能得到供体细菌的某一性状：如：（供体） S，Ampr R，Amps （受体） R, Ampr或 S，Amps共转化（cotransformation）：受体细菌吸收外源DNA后，同时出现两个遗传性状改变的现象。共转化的两个基因可以在同一个DNA片段上（连锁关系），也可在不同的DNA片段上。 DNA浓度与转化频率关系两个连锁共转化基因（a, b）形成共转化子数（cotransfer index）:共转化子数= （a+b+, a+b-, a-b+三种转化子）一、接合现象的发现1946年，莱德伯格(Lederberg)和塔特姆(Tatum)发现细菌接合现象：E.coli k12两个不同营养缺陷型菌株作亲本：亲本： bio- met- thr+ leu+ （需生物素和甲硫氨酸）亲本： bio+ met- thr- leu- （需苏氨酸和亮氨酸）接种实验：接种亲本 基本培养基平板无菌落 （bio- met-营养缺陷型）接种亲本 基本培养基平板无菌落 （thr- leu-营养缺陷型）亲本、混合培养 基本培养基平板菌落（bio+met+thr+leu+野生型，10-8频率）解释： 1、上述重组体不是亲本回复突变的结果（突变率10-8，两基因同时回复突变可能性10-810-8=10-16）2、两种细菌只有接触才能产生重组子接合作用 证明细菌接触与重组相关性的U型管接合试验1953年海斯（Hayse）正反交实验证明：细菌重组的发生只是染色体单方向的转移，且染色体转移不完全。实验：正交：Strs（雄） Strr（雌） 反交：Strr（雄） Strs（雌） 重组子（培养基含链霉素） 无重组子（培养基含链霉素）解释： 1、染色体从雄性菌转移到雌性菌，且在雌性菌的细胞中渗入了供体染色体的某些片段。 2、接合作用是必须有细胞间的接触，染色体呈单向转移的一种基因重组方式1、F因子： 供体菌细胞中含有一种致育因子（fertility, F因子） F+（供体菌） F-（受体菌） F+说明：F因子是独立于细菌染色体外的遗传因子（一种质粒）带F因子的F+细胞能形成性菌毛（F质粒上的结构基因所决定）F+细胞所带的F因子是通过复制转移F因子基因组分三个区段： 控制自主复制：含复制酶基因、决定不相容性的基因和复制起点；转移区段：由23个基因组成的一个具转移功能的操纵子插入区段：含4个插入序列（IS3，IS2，IS3），利于F因子在不同位点插入受体菌染色体而形成不同的高频重组（Hfr）菌株2、F因子的存在状态及它们之间的关系 根据F因子的有无及存在状态，把E.coli分为四种类型： F-细菌：细胞不含F因子 F+细菌：细胞中含有游离于染色体的F因子 Hfr菌株（高频重组菌株）：F+细胞中的F因子通过重组插入细菌染色体中形成Hfr细胞。 F细菌：Hfr细胞中的F因子即可以从染色体上沿原插入位点正常脱离下来恢复成F+，也可误差脱离而形成F细胞。 F+F-的接合作用： F+ F- F因子DNA的一条单链在oriT处打开，并以其5端为首 通过胞质桥的通道进入受体，在F因子转移的同时，供体和受 F+ 体细胞中的两条单链都以滚环合成的方式，由单链复制成双链。F+F-接合过程中，供体菌本身的染色体DNA并不发生转移。HfrF-的接合作用： F-高频重组作用（high frequency recombination） HfrF-的接合作用使部分染色体基因转移的频率比F+F-高1000倍以上。Hfr细胞中，F因子与染色体结合成一个复制子，F因子在接合转移时能带动部分染色体DNA进入受体。杂交中断转移： F因子整合在E.coli的不同位点上，转移时首先是F因子和oriT和小部分DNA先进入受体，然后是染色体DNA，最后才是剩下的大部分F因子的DNA，由于外界干扰中途会出现杂交转移中断停止现象，杂交子绝大多数仍是F-细胞。FF-的接合作用：F F- FF因子：F质粒在脱离Hfr细胞的染色体时会发生差错，从而形成带有细菌某些染色体基因的F因子。F因子转导（性因子转导），在F F-接合作用中，能专一性地向F-转移F质粒携带的供体菌基因，从而使受体菌改变其遗传性状。三、中断杂交试验及基因定位原理：HfrF-杂交中Hfr细胞的染色体从整合的F因子的oriT位点开始逐渐向F-细胞转移。由于转移过程随时被中断，靠近转移起始点的基因会有更多机会出现在F-细胞中，愈是后端的基因转移的机率愈小。方法：中断杂交试验：在接合的特定时间内人为地中断杂交以测定重组子的方法。基因定位：根据接合后F- 细胞中来自Hfr细胞的基因出现的频率就可以判定基因转移的先后及其在染色体上的位置。结论：杂交时间越长，从Hfr细胞转移到F-细胞中的基因越多。一、转导作用的发现1952年莱德伯格和津德（Zinder）研究鼠伤寒沙门氏菌的遗传重组时发现了转导现象。实验：鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型： LT-2（met-, his-） LT-22 （phe-, trp-, tyr-） 基本培养基（原养型菌落，10-5频率）验证：U型管装置接合试验： U型管LT-22的一端有原养型菌落出现。解释：溶源性菌株LT-22自发释放的P22噬菌体通过隔板的微孔进入LT-2端，并侵入LT-2细胞内将LT-2细胞裂解，裂解后携带了LT-2的某些遗传因子的噬菌体，再进入LT-22端并侵入LT-22细胞内，经溶源性整合使LT-22获得LT-2的某些性状，因而出现原养型菌落。转导的组成及本质：转导作用包括供体、转导噬菌体和受体三部份，它不需供、受体菌的直接接触，而以噬菌体为媒介来达到基因重组的目的。二、转导噬菌体的类型依据来源和性质，转导噬菌体（transducing phage）分普遍性转导噬菌体和局限性转导噬菌体二类。1、普遍性（generalized）转导噬菌体是许多温和噬菌体或者某些烈性噬菌体感染供体菌后，在裂解过程中因错误包装而产生的。普遍性转导中，转导颗粒中包裹的主要是供体菌的DNA，所形成的是非溶性转导子，如:沙门氏菌噬菌体和P1（E.coli噬菌体）。2、局限性（specialized）转导噬菌体是温和噬菌体感染供体菌后，先经溶源反应整合，最后再经诱导而产生的，如E.coli的和80。 噬菌体：双链DNA分子，由噬菌体颗粒中提取的DNA为线状，当DNA进入寄主细胞后迅速环化，并开始基因表达。DNA进入寄生细胞后有两条途径：一是裂解途径：DNA复制并转录翻译出头部和尾部蛋白，装配后裂解宿主细胞，释放大量的子代噬菌体。二是溶源途径：的大多数基因被噬菌体上阻遏蛋白cI产生的阻遏蛋白抑制，DNA整合到宿主染色体上，以原噬菌体的状态，随寄主染色体一起复制，细胞仍然存活，也不产生噬菌体。三、转导的类型及过程1、局限转导（specialized transduction）：只能使供体的一个或少数几个基因以噬菌体为媒介转移到受体的转导作用。 说明：插入Ecoli的gal和bio基因之间。 1962年坎贝尔（Campbell）提出局限转导模型： 感染寄主细菌DNA环化，并以它的附着位点att和染色体的同源部分发生配对通过一次交换后DNA直线地整合到寄主染色体上，并与寄主同步复制（原噬菌体：插在染色体的gal和bio基因之间）。经UV等诱导后，原噬菌体（DNA整合在寄主染色体上）脱离寄主染色体，通常正常脱离形式噬菌体，也可以极低的频率发生偏差的错误脱离。错误的脱离：向左偏离，脱离的DNA含有gal基因，形成转导噬菌体dg（即携带有gal基因的缺陷型）。向右偏离：则含有bio基因，形成转导噬菌体db（失去正常的某些功能而成为缺陷溶源性噬菌体）.转导噬菌体dg丢失了本身的一部分基因，所以dg是没有感染能力的。低频转导：整合的原噬菌体发生错误脱离的机率约为10-6，经诱导得到转导噬菌体dg的频率也是10-6。低频率转导的结果：稳定的转导：dg携带的gal基因与受体上发生突变的gal基因双交换而取代突变基因，gal会稳定随染色体一起复制（占全部转导子的1/3）。不稳定的转导：dg与受体染色体不发生交换而仅以附加体的形式游离于受体细胞中，使受体细胞成为既有gal基因也有gal突变基因的杂基因子（转导子约占2/3，转导不稳定）。双重溶源菌：dg没有感染能力，当dg和噬菌体同时感染一个细菌时，dg的缺陷被所补偿。先在att位置以正常方式整合（溶源化），而产生一个“杂合”的附着位点，此位点能与dg的杂合位点联会而整合，形成/dg的双重溶源菌高频转导（high frequency transduction，HFT）/dg双重溶源细菌经诱导，两种噬菌体都能成熟，裂解液中含有等量的和dg噬菌体，用这种裂解液去感染Gal细菌，大约有50%的转导噬菌体能转导gal基因。2普遍性转导（general transduction）供体的单个或紧密连锁的少数基因被噬菌体因误差装配而转移给相应受体的作用称为普通性转导。转导机制选择性包裹模型：P1噬菌体 ： E.coli的烈性噬菌体P1 DNA注入细菌立即进入裂解循环在寄主体内复制、转录mRNA并合成噬菌体外壳蛋白同时，P1编码的核酸酶将寄主DNA降解（10-100MD片段）装配时绝大多数外壳蛋白选取P1的DNA装配，形成正常P1噬菌体偶尔会发生一次错误而将相应大小的寄主DNA片段装入而形成转导噬菌体（10-5-10-7机率）。普遍性转导是由错误装配产生的，因寄主的任何一个基因都有可能被它们转导，故称为普遍性转导。共转导（并发转导）：少数情况下两个基因同时被转导。普通转导结果：完全转导（稳定的转导子，大菌落）：由噬菌体导入的DNA片段通过双交换整合到受体染色体上与寄主染色体同步复制。流产转导（不稳定的转导子，小菌落）：E.coli完全转导需RecA和RecBC重组蛋白参加，如果重组蛋白有缺陷，供体DNA片段（不能独立复制）不能整合到受体染色体上，因而在细胞分裂过程中，只有一个细胞能获得导入的片段而成为单线传递的方式（个别获得供体片段的细胞正常，其它多数细胞仍保持受体的缺陷型性能，只能依靠细胞内残存的酶分裂）。四、转导遗传分析1、利用共转导进行基因定位： P1能用于E.coli的基因定位：P1能共转导任何两个相邻的基因 共转导频率=（1-d/L）3 L：噬菌体外壳蛋白包装的DNA大小（以分钟表示） d：两个待测基因之间的距离（以分钟表示）（供体）T+L+ T-L-（受体）将转导子涂布在不含色氨酸（Try）只含亮氨酸（Leu）基本培养基上，得到转导子：T+L+和T+L-。将转导子涂在不含色氨酸和亮氨酸的基本培养基上,得到转导子:T+L+则：T和L共转导频率=2、利用流产转导进行互补测验基因的顺反位置效应：一个基因（或一个顺反子）是一个完整的不可分割的功能单位，属于同一基因的两个突变型不能互补。如果两个突变型能互补，证明它们属于两个不同的基因。如某次实验的转导结果：Leu A Leu B 产生流产转导子 说明：A、B是决定Leu的两个不同基因Leu A1 Leu A2 不产生流产转导子 说明：A1、A2是A基因内部的两个不同突变位点。一、链霉菌基因重组的发现：1955年塞蒙梯（Sermonti）夫妇首次发现天蓝色链霉菌（S.coelicolor）可通过遗传交换产生重组体。二、放线菌的致育因子天蓝色链霉菌致育类型：存在致育因子SCP1原始致育型IF（相当于E.coli的F+）：含SCP1正常致育型NF（相当于E.coli的Hfr）：含SCP1（存在状态不一样）超致育型UF（相当于E.coli的F-）：不含SCP1三种致育型菌株之间的关系：IFUF杂交，后代全部转变为IF，但基因重组的频率都相当低（相当于F+与F-杂交）NFUF杂交，染色体基因重组的频率高（高频重组，相当于HfrF-杂交）从IF菌株可以得到UF菌株，也可得到NF菌株，而且经过消除剂的处理后得到UF的频率可以提高。天蓝色链霉菌与E.coli致育因子区别：E.coli中F-F-不可育，但UFUF杂交中得到少数重组子，表明它们可育，证明天蓝色链霉菌含SCP1外，还有另一致育因子SCP2。E.coli中F+F+或HfrHfr杂交一般不育， NFNF，IFIF杂交中有一部分高度可育。E.coli中，HfrF-，子代基本是F-（染色体单向梯变转移） 天蓝色链霉菌中，NFUF杂交，子代都是NF（染色体是双向梯变转移）。三、异质系的产生异质系的产生是放线菌基因重组的一种特殊方式。它是由供体染色体的片段进入受体细胞后，并不经过双交换而整合到染色体上，而是通过两次不同的单交换而形成的。 第四章噬菌体（bacteriophage）：是一类感染细菌的特殊病毒。1、依其遗传物质的性质分： SS DNA （SS: 单链） SS RNA ds DNA （ds: 双链） ds RNA2、依其与宿主细胞的关系分： 烈性（virulent）噬菌体温和（temperate） 噬菌体 噬菌体的感染特性：包括：噬菌斑、涂布效率、感染复数和裂解量。噬菌斑（plague）：噬菌体感染敏感宿主细菌后在含受体菌的涂布平板上形成的肉眼可见的透明圈。噬菌斑的特征：大小、形状、透明度、边缘涂布效率：单个噬菌体颗粒侵染敏感细菌后产生的噬菌斑数量称为涂布效率（efficiency of plating，e.o.p.）。理论上e.o.p. 应为1，有时某些烈性噬菌体的e.o.p.远低于1（10-4）。原因：宿主细菌或噬菌体因发生基因突变而产生了抗性细胞或突变噬菌体；来自宿主细菌菌株的限制修饰作用。E.coli两菌株: C和KE.coli噬菌体C, E.coli噬菌体k （c DNA甲基化变成k）1）cE.coli CC（e.o.p.=1）2）cE.coli KK（e.o.p.=10-4）E.coli KK（e.o.p.=1）3）kE.coli CC（e.o.p.=1）2）的解释：E.Coli K中有限制性内切酶I，切割外源DNA，所以大量的C DNA被破坏，同时，少量c被E.Coli K中的修饰酶甲基化形成K，不被限制性内切酶I切割。3）的解释：k噬菌体恢复了c的感染特性。感染复数（multiplicity of infection，m）：单个宿主细菌细胞感染的噬菌体颗粒数。m1000时：宿主细胞因噬菌体的过度侵染而死亡。m在2-5之间：制备、扩增或保存噬菌体。m在5-10之间：噬菌体杂交试验。裂解量（burst size）：系感染烈性噬菌体之后的单个宿主细胞所释放的子代噬菌体的平均数量。测定方法：将供试噬菌体与敏感细菌按一定的m值混合，吸附5min将菌液稀释至每亳升只含2-3个敏感细菌细胞从中取0.2ml分装一系列试管（每一试管平均不到1个寄主细胞）保温30min后将释品与大量敏感细菌混合再涂平板经培养后统计计算每一培养皿的平均噬菌斑数（裂解量）。烈性噬菌体：感染敏感的宿主细胞之后立即在受体细胞内进行核酸复制，mRNA转录和翻译出外壳蛋白，再装配许多噬菌体粒子，并最终将宿主细胞裂解而一次性释放出来以进入下一次裂解循环。感染具宿主专一性，少数噬菌体可同时感染多种细菌宿主（广范围宿主型）基因突变可改变烈性噬菌体感染的宿主专一性。一、T4的琥珀突变和遗传分析E.coli T4基因组是具末端重复环状排列的线状双链DNA，167Kb，上百个基因，编码的早期蛋白主要用于解除宿主细菌的功能和确保噬菌体DNA的复制。琥珀突变（amber mutation）：又称无义突变，当基因组中因编码氨基酸的密码突变为终止密码（UAG、UAA和UGA）并致使