2011年基因工程大实验讲义.doc

各位同学： 本学期的植物基因工程实验定于第十一周的周一至周六（10.31-11.5日）在综合楼513室进行。望各位同学提前打印好实验讲义，并在每次实验之前对相应实验内容做好充分预习。（实验讲义内容及日程安排见网络教学平台。用户名2009chenshihua密码：123 具体实验试验内容如下：大实验一 目的基因的克隆（共计8学时）实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA （4学时）实验二 反转录PCR （4学时）实验三 目的基因的PCR扩增（中间穿插准备下次实验相关材料）（4学时）大实验二 表达载体的构建（共计24学时）实验一 琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增基因产物的回收及重组载体的构建 （4学时）实验二 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法） （4学时）实验三 质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选（4学时）实验四 质粒（碱法）提取及电泳检测 （4学时）实验五 重组载体（质粒）的酶切和电泳检测 （4学时）大实验三 目的基因的遗传转化及分子筛选/检测（共计16学时）实验一 植物转基因操作：渗透法转化拟南芥及转化子筛选 （4学时）实验二 植物基因组DNA的提取及电泳检测 （4学时）实验三 转基因植物的PCR检测（及转基因动植物相关检测方法介绍） （4学时）实验四 -葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物（4学时）基因工程综合实验具体日程安排：周一上午： 总RNA（Trizol试剂）快速提取周一下午： RNA电泳检测及反转录PCR周二上午： 目的基因的PCR扩增（中间穿插准备后面实验用的LB培养基）周二下午： 琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR扩增基因产物及重组载体的构建周三上午： 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）周三下午： 质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选周四上午： 植物基因组DNA的提取及电泳检测周四下午： 转基因植物的PCR检测（及转基因动植物相关检测方法介绍）周五上午： 质粒（碱法）提取及电泳检测周五下午： 重组载体（质粒）的酶切及电泳检测周六上午： 植物转基因操作技术：渗透法转化拟南芥及转化子筛选 周六下午： -葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物目录实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA实验二 反转录PCR（RT-PCR）实验三 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物（DNA）实验四 从琼脂糖凝胶中回收（PCR 产物）DNA片段实验五 DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA）实验六 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测实验七 质粒转化实验八、九 质粒（碱法）提取及重组质粒（重组子）的筛选和酶切检测实验十 渗透法转化拟南芥及转化子筛选实验十一 植物基因组DNA的提取及转基因植物PCR检测实验十二 转基因植物的PCR检测实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA实验目的 学习用试剂盒从植物组织中提取总RNA的方法。实验原理RNA是一类极易降解的分子，要获得完整的RNA必须在提取过程中最大限度地抑制内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解作用。高强度变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA，蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA，LiCl可以选择性的沉淀RNA，使RNA进一步得到纯化。TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。焦碳酸二乙酯（DEPC）：一种高活性的烷化剂，通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNase活性。因此常用于灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNase。抑制RNase的活性：准备溶液时使用无RNase的玻璃器皿、DEPC 处理过的水。180-300烘烤玻璃器皿4小时。用DEPC或其他商业化产品处理塑料制品。 尽量使用无RNase的一次性移液器头和微量离心管。在从原包装取出这些小器具时最好使用无菌的镊子！ 在分离RNA的过程中用抑制剂抑制RNase的活性。实验仪器、材料与试剂（一）仪器 1. 低温离心机2. 200以上烘箱3. 琼脂糖凝胶电泳系统4. 紫外线透射仪5. 高压灭菌锅6. 恒温水浴锅7. 陶瓷研钵8. 微量移液器（二）材料1. 新鲜植物组织2. 1.5ml Eppendorf 离心管3. 剪刀、一次性手套等（一） 试剂1. Trizol试剂2. 氯仿3. 异丙醇4. 70%乙醇5. 焦碳酸二乙酯（DEPC）实验步骤1. 称取100mg新鲜植物植株，液氮研磨成粉末移入DEPC处理并灭菌的1.5 ml Eppendorf离心管。2. 加入1ml Trizol 试剂， 充分混匀。3. 1530，5min。4. 4，13000rpm,10min。5. 取上清，加入氯仿200l，混匀，1530，放置25min。6. 4，12000rpm,10min。7. 取上清移至另一1.5ml Eppendorf 离心管，加预冷的异丙醇500l，1530，10min8. 4，12000rpm,10min（RNA成胶状）9. 弃上清，加1ml 75%乙醇（用DEPC 水配制），漩涡器上加一张滤纸涡匀。10. 4，9000rpm,5min。11. 弃上清，用灭菌枪头超净台吸干，超净台上风吹干510min.12. 用不含RNase的水（DEPC 水）溶解RNA （用枪头反复吸打）13. 5565，水浴10min(破坏二级结构)14. -20，可以暂存，然后做反转录。思考题：1、RNA提取中需要注意的问题有哪些？实验二 反转录PCR（RT-PCR）实验目的学习用试剂盒进行反转录PCR的方法。实验原理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到1067个拷贝。PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。反转录PCR扩增是指以RNA为模板，经过反转录酶的作用，通过聚合酶链反应（PCR）合成cDNA，并利用基因特定的引物，以合成的cDNA为模板进行PCR反应，从而克隆目的基因或检测特定基因的方法。实验仪器、材料与试剂（一） 仪器1. PCR仪2. 台式离心机3. 琼脂糖凝胶电泳系统4. 微量移液器（二） 材料1 植物总RNA2 上、下游引物（正向引物、反向引物）（三） 试剂1. TaKaRa的RNA PCR Kit (AMV)Ver.2.12. 琼脂糖凝胶电泳所需试剂实验步骤1. 反转录反应反转录反应利用TaKaRa的RNA PCR Kit (AMV)Ver.2.1进行。按下列反应组成调制反转录反应液 (20l体系)：MgCl24l10 RNA PCR Buffer2lRNase Free dH2O8.5ldNTP Mixture2lRNase Inhibitor0.5lAMV Reverse Transcriptase1lSpecific reverse primer or Oligo dT-Adaptor1l植物总RNA(1g)1l按以下程序进行反转录反应：42 30min，99 5min，5 5min。2. PCR扩增：按下列反应组成调制反应液（50l）：10 RNA PCR Buffer（含Mg+）5l灭菌蒸馏水39.5lTaKaRa Taq0.5l上游引物1l下游引物1ldNTP Mixtures1l模板(反转录产物)1l轻轻混匀后，按以下条件进行PCR反应：预变性94 2 min；变性94 30 sec，退火56 30 sec，延伸72 1.5 min，30个循环；保温72 10 min；4保温。用1的琼脂糖凝胶电泳检测基因扩增情况。思考题：简述反转录反应的意义。实验三 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物（DNA） 实验目的了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。实验原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，也是分离和纯化DNA的常用方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10ng的DNA）且检测的范围很广。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。溴化乙锭为一种有毒试剂，使用时一定要戴手套操作，注意防护。实验仪器、材料与试剂（二） 仪器 1. 水平式凝胶电泳槽2. 稳压电泳仪3. 电炉4. 紫外检测仪5. 台式离心机（三） 材料 实验二中获得的PCR产物 （DNA）。（四） 试剂 1. 琼脂糖2. 50TAE电泳缓冲液贮存液配方：(50)每升Tris（M=121.14） 242g冰醋酸 57.1ml0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml1缓冲液浓度：0.04mol/L Tris HAc、0.001mol/L EDTA3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。1.0g 溴乙锭100ml 三蒸水4. 10DNA样品上样缓冲液附注：1.核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，分别是Tris硼酸(TBE)、Tris乙酸(TAE)和Tris磷酸(TPE)。在上述三种缓冲液中：TBE与TPE缓冲液容量高，对DNA的分离效果好，但TPE液中含磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀。TAE液的缓冲容量低，价格较便宜。本实验选用的是TBE缓冲液。缓冲液中的EDTA可螯合正价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR产物被降解。10倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。Tris108 gEDTA9.3 g硼酸55 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000 mL，调节pH为8.08.2备用，使用时需稀释10倍。2.影响DNA片段琼脂糖电泳的几个因素：1. DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。2. 琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶浓度可分辨的线性DNA片段大小（kb）0.45600.70.8101.00.461.50.241.750.232.00.133. DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。4. 电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。实验步骤1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子，晾干。2. 插好梳子。3. 实验所需凝胶的浓度通常为0.8-1%，依据所需配制的凝胶体积,称取一定量的琼脂糖，放入制胶的容器中（一般用三角瓶），然后加入适量的电泳缓冲液（1TAE）。4. 将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。5. 关闭电炉，取下三角烧瓶，溶液冷至约60-70时(手握烧瓶可以耐受)，在琼脂糖溶液中加入溴化乙锭至终浓度为0.5g/ml，轻轻摇匀（避免剧烈摇晃产生气泡），倒入制胶槽内，检查有无气泡。6. 室温下约10-20分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。7. 加入电泳缓冲液（1TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1-2mm。8. 取PCR 获得的DNA样品20l，加入1/10体积的10DNA上样缓冲液（10 loading buffer） ，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。9. 用移液器轻轻吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。10. 插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压（或电流），电泳开始，观察电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。13. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml离心管中，放入-20冷冻保存，以备以后的实验用。思考题：在进行琼脂糖电泳操作过程中，应注意采取哪些保护措施防止溴乙啶污染？ 实验四 从琼脂糖凝胶中回收（PCR 产物）DNA片段实验目的 了解DNA片段回收的原理，掌握用试剂盒回收DNA的方法。实验原理 本实验所用的回收试剂盒的原理是在NaI存在的条件下，使含有DNA片段的凝胶融化，使DNA片段吸附于硅胶树脂上。最后用TE缓冲液或灭菌水溶出DNA。实验仪器、材料与试剂（一） 仪器 1. 高速台式离心机2. 微量取液器（二） 材料实验二切下的含有回收片段的琼脂糖凝胶（三） 试剂除试剂盒所带外，余同实验二。实验步骤1. 样品用琼脂糖凝胶电泳后，将目的DNA片段切出。 2. 将切下的凝胶块放入1.5 ml的Eppendorf tube中。注意：制作琼脂糖凝胶及电泳时，建议使用TAE缓冲液。 3. 向反应管中加入约1.53倍凝胶量的NaI溶液 (通常600 ml), 55加热510分钟, 使凝胶完全融化。 4. 按每20 ml硅胶树脂结合约1 mg DNA的比例加入适量的硅胶树脂后，充分混和，室温放置20分钟。注意：在使用硅胶树脂前，一定要将硅胶树脂液充分搅匀。 5. 离心 (5,000g, 1分钟) 后，除去上清。注意：此上清液在整个回收过程结束后，确认回收率较高时方可扔掉。如果回收率较低 时，可在此上清液中再次加入硅胶树脂液，重新回收。 6. 在反应管中加入500 ml洗净用缓冲液, 振荡搅匀后离心 (5,000g, 1分钟), 除去上清。此操作重复一次。 7. 离心后除净上清液，加入TE缓冲液或灭菌蒸馏水后搅匀，55水浴中放置5分钟。注意：TE缓冲液或灭菌蒸馏水的添加量为硅胶体积的1倍。8. 离心 (5,000g, 1分钟)，回收上清液，此上清液即为回收的DNA溶液。注意：再重复一次7. 8. 的操作可提高回收率。9. 琼脂糖凝胶电泳检测定量回收DNA。DNA回收操作流程思考题：琼脂糖凝胶中回收DNA产物操作过程中应特别注意哪些操作环节？实验五 DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA）实验目的 了解DNA片段连接的原理，掌握DNA连接的方法。实验原理 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来。实验仪器、材料与试剂（一）仪器 1. 恒温水浴锅或恒温箱2. 微量取液器（二）材料实验四回收的DNA片段。（三）试剂试剂盒所带实验步骤1. 含有质粒载体DNA（0.03pmol）及插入片段DNA（0.10.3pmol）的DNA溶液（TE缓冲液或去离子水），总体积为510l。2. 加入与DNA溶液等量的Solution I（510l）混合均匀，Solution I溶液中含有连接酶和酶反应缓冲液。3. 16*1连接反应30min*2（通常连接过夜效果较好）。4. 当直接进行转化时，取上述连接反应液1020l *3转化至100l的感受态细胞。*1 如果反应温度升高（26），较难形成环状DNA。因此反应必须于16进行。*2 当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。当连接效率仍然无所改变时，应当对DNA进行精制后再反应。*3 连接反应液可以直接用于转化，如发现转化效率偏低时，反应结束后向反应液中添加NaCl使其终浓度为500mM，然后进行转化，可改善转化效率。另外，当转化DNA量较大或者利用电刺激转化时，先用乙醇沉淀法精制DNA。操作流程图实验六 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测实验目的学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。实验原理用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1. 恒温摇床2. 超净工作台3. 高压灭菌锅4. 低温离心机5. 微量取液器（二）材料大肠杆菌DH5。（三）试剂1. LB液体培养基（1升/组）胰蛋白胨 10 g酵母提取物 5 gNaCl 10 g加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。LB固体培养基（1升/组）在上述LB液体培养基（1升）中加入琼脂粉15g。2. 0.1mol/L CaCl2溶液，高压蒸汽灭菌。实验步骤1. 挑取大肠杆菌DH5的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中,37振荡培养12h。2. 取2ml菌液加入50ml LB液体培养基中,扩大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5时，停止培养。3. 菌液放置在冰上30min，无菌条件下倒入50ml Beckman离心管中，4，3,500rpm离心5min。4. 弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放置15min。5. 4，3,500rpm离心5min。6. 弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新悬浮细胞，200l/份分装到预冷的无菌Eppendorf管中，4保存备用，在一周内转化率基本不降低；如加入15%的甘油，-70保存，可保存一年。7. 制备的大肠杆菌感受态的活性可通过实验七“质粒的转化”进行验证，转化效率高表明则表明制备的感受态活性高。思考题：在感受态制备过程中，影响感受态活性的主要因素有哪些？ 实际操作过程中通常采取哪些措施避免这些不利影响？实验七 质粒转化实验目的了解细胞转化的概念及其在分子生物学上研究中的意义；学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化体的方法。实验原理转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态。用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细胞进入一个敏感的感受状态，以便外源DNA进入细菌内。目前，感受态的制备方法很多，如CaCl2法、Hanahan法、超级感受态法和电转化法，相比之下，CaCl2法操作简便，重现性好，转化率一般能达到5106-2107转化子/g质粒DNA，可以满足大多数的实验要求，为人们广泛接受，很多尖端实验室仍然在使用。这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被噬菌体DNA感染，随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌，其原理是细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。实验仪器、材料与试剂（一）仪器和器皿1. 恒温摇床2. 超净工作台3. 恒温水浴锅4. 恒温箱5. 微量取液器6. 高压灭菌锅7. 玻璃培养皿（二）材料1. 实验五所得连接产物2. 实验六制备的大肠杆菌感受态细胞（三）试剂1. LB液体、固体培养基2. 氨苄青霉素（Amp） 100mg/ml实验步骤1. 取适量连接产物加到分装的感受态细胞中，混匀，冰浴30min；2. 42热激90s，迅速在冰浴中冷3-5min；3. 上述管中加入600l LB液体培养基,于37振荡培养45min-1h；4. 菌液低速离心（3,500rpm离心2min）倒掉部分上清液，保留约200l，重悬菌液。5. 取适量（100l）菌液涂布LB平板(含Amp 50g/ml)，室温涂布均匀后（至菌液完全被吸干），于37倒置，过夜培养过夜；6. 观察菌落，筛选阳性克隆（利用T-载体连接的可利用兰白斑筛选）。LB平板：加热融化LB固体培养基，冷却至60左右，按50g/ml加入Amp ，倒入灭菌的培养皿中，每50 ml培养基可倒3个平皿。 思考题：1、质粒转化的机理？ 2、影响转化效果的主要因素有哪些？ 实验八、九 质粒（碱法）提取及重组质粒（重组子）的筛选和酶切检测 实验目的了解碱法提取质粒的原理，掌握碱法提取质粒的方法。 实验原理质粒是一种染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性抽提法，羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法，酸酚法，两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上各种方法均有利弊，有的难以控制；有的得率不高；有的手续繁琐；还有的纯度不高。因此在制备质粒DNA时，要考虑三方面的因素，（1）质粒特性：如质粒宿主的菌属，是否需要用溶菌措施；质粒DNA的大小，分子量大的在制备过程中易受损伤，DNA产生缺口；拷贝数，构型，复制型是否需要氯霉素扩增；（2）提取质粒DNA的用量与用途：如用于重组子的鉴定，进行酶切，作探针，测序等；（3）提取方法的成本，程序，重复性，实验室具备的条件等。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性而达到分离目的。在碱性条件（pH12.5）下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，但质粒DNA呈超螺旋共价闭合环状，两条互补链不会完全分离，当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时变性的染色体DNA与细胞碎片、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2 和Mg2 螯和,抑制DNase的活性,溶液II裂解细菌,变性蛋白质和少量质粒,溶液使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀,质粒DNA复性 4 。因此如果实验中缺少了溶液,用LB 液体培养基代替之也可以,只要在短时间内完成质粒的提取即可。裂解细菌主要是溶液II中的NaOH, 而不是SDS,所以叫碱裂解法,若只用SDS也能抽提得到少量质粒,这是因为SDS也是碱性的,但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。另外, NaOH若不是新配制的,可能会由于空气中的CO2 与NaOH作用,减弱了其碱性。这一步操作要注意两点:一是,放置时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂 5 。二是,混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。加入溶液后,会有大量的沉淀生成,这是由于要SDS与蛋白质结合后,SDS与醋酸钾生成了PDS, PDS的溶解度要比SDS低的多,从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了。若用醋酸钠代替醋酸钾,所得到的沉淀就会大大减少小规模制备质粒DNA的特点是可以一次制备多种质粒，速度快，时间省，步骤简化，DNA纯度好，可以用于酶切，连接，甚至还可做双链DNA序列分析的模板等常规基因工程操作之用。实验仪器、材料与试剂（一） 仪器1. 恒温摇床2. 超净工作台3. 高压灭菌锅4. 高速台式离心机5. 微量取液器（二） 材料含质粒的大肠杆菌DH5。（三） 试剂1. LB液体培养基2. 质粒提取溶液50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris-Cl (pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0)高压灭菌后，4保存备用。3. 质粒提取溶液(新鲜配制)0.2mol/L NaOH1% SDS4. 质粒提取溶液 （100ml）5mol/L Kac 60ml冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸（pH 4.8）。5. 氨苄青霉素（Amp） 50mg/ml，置-20冰箱保存备用。胰RNA酶的处理： 将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L Tris-Cl (pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。6. TE缓冲液 含20ug/ml Rnase A。（每1ml DDW中加10mg/ml Rnase A 母液 2ul）7. Tris-Cl(pH8.0)饱和酚，氯仿，异丙醇或无水乙醇，70%乙醇8. 限制性内切酶 EcoR，Xba I实验步骤（一）质粒的提取1. 取实验七培养获得的平板，用灭菌的牙签挑取白斑单菌落（已连入外源基因片段的重组质粒）放入5ml LB液体培养基（含Amp）中，（用灭菌封口纸封闭试管口）37振荡培养过夜。2. 将过夜培养的菌液(每次按1.5 ml菌液)倒入Eppendorf管中，10,000rpm离心1min，去掉上清液，重复前述过程，收集菌体3次，沉淀悬于100l 溶液I 中,涡旋使充分悬浮。3. 加入200l 溶液II,混匀，冰浴5min（冰浴环节可省略）。4. 加入150l 溶液III,混匀，冰浴5min（冰浴环节可省略）。5. 4，12,000rpm离心5min，将上清移至1个新Eppendorf管中。6. 加入等体积酚：氯仿：异戊醇（V/V,25241），混匀，4，12,000rpm离心15min， 取上清液。7. 重复步骤6操作过程8. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇或2.5体积的无水乙醇，-20沉淀30min-2h。9. 12,000rpm离心15min。10. 倒掉上清，沉淀加入500l 70%乙醇洗涤2次。11. 12,000rpm离心3分钟，去掉上清。室温或真空干燥沉淀。12. 每管中加入30lTE缓冲液,37溶解质粒DNA。（二）质粒酶切在0.5mlEp管中调制酶切体系如下: 在20l反应体系中，加入无菌水12l，10Buffer H 2l,20lSac I 0.5l, Xba I 0.5l,质粒5l。在对照酶切体系中不加限制性内切酶，其余与上述体系相同，用水补足体积。37酶切2-3小时，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。思考题：1、碱裂解法提质粒过程中，溶液的作用是什么？氯仿的作用是什么？2、质粒酶切操作时质粒的用量与什么因素相关？ 实验十 渗透法转化拟南芥及转化子筛选实验目的学习渗透法转化拟南芥的方法及筛选转化子的方法。实验仪器、材料和试剂（一）仪器 1. 恒温摇床2. 微量取液器（二）材料 1. 农杆菌（含带有外源基因的质粒）2. 拟南芥（已经开花）（五） 试剂1. 利福平 34 mg/ml2. 卡那霉素 10mg/ml3. LB液体培养基4. 农杆菌渗透培养基：1/2MS，5 %蔗糖，0.5g MES/L，1mg/mL的6-BA母液10L/L，Silwet L-77 200L/L，pH5.75. 0.1%琼脂6. 固体筛选培养基：1MS salt，1%蔗糖，pH0.8，0.8%琼脂，pH5.7，卡那霉素30mg/l7. 70%乙醇8. NaClO溶液9. 无菌水实验步骤1. 植物的生长拟南芥种子播种于盛满培养土的直径7cm的培养杯中，用一纱网覆盖，萌发2-3天后移至4光照培养箱中放置一周（进行春化），再放到21的组织培养室中生长。植株长出的花序其下部的花出现授粉现象时（通常说的开花时）进行转化。转化前，将已授粉花及荚果除掉。2. 菌液的准备挑取鉴定好的农杆菌单克隆放于20ml含有100mg/L利福平、50g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28，250rpm震荡培养至OD600为0.5左右。在转化前一天，转入含50g/ml卡那霉素的LB液体培养基的大瓶中培养过夜。第二天，当菌液OD600在1.2-1.6之间时取出使用。3. 渗透转化制备好已转化了外源基因（此处是带有yAP1基因）植物表达载体质粒的农杆菌菌液100mL，室温5,000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基（1/2MS，5 %蔗糖，0.5g MES/L，1mg/mL的6-BA母液10L/L， Silwet L-77 200L/L，pH5.7）中，重悬后的菌液OD600值在0.8左右。将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将长有拟南芥的培养杯倒扣其上，保证莲座叶以上部分浸没于液体中，浸泡15分钟，取出植株（或用吸管吸取重悬的菌液逐一滴在开放的拟南芥花朵上）。农杆菌悬浮液浸染的植株横放在塑料盘中，用保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室培养。第二天打开，竖直培养，仍用保鲜膜保持湿度3-4天。根据情况可再对开放的拟南芥花朵连续浸染多次。培养三至四周，待种子成熟后，收取种子，干燥器中存放2周，4春化约一周。4. 转化子的筛选种子消毒：先用70%的乙醇浸泡2分钟，再用1%(体积比)NaClO溶液涡旋洗涤15分钟，无菌水漂洗5-6次，用0.1%的琼脂重悬浮种子，均匀分散到固体筛选培养基( 1MS salt，1%蔗糖，pH0.8，0.8%琼脂，pH5.7，卡那霉素30mg/l)表面上，4春化一周，放入恒温组织培养室培养。大约两周后，即可区分转化株与未转化株在含卡那霉素的培养基上黄化），（保持绿色的）转化株移栽到土中以收取T1代种子。实验十一 植物基因组DNA的提取实验目的掌握提取植物基因组DNA的原理，学习从植物组织中提取基因组DNA的方法。实验原理1、核酸的理化性质l DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。核酸和核苷酸 大都呈酸味（除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外）。DNA、RNA和核苷酸都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。l 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP 表示；DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必须破碎（或消化）细胞壁释放出细胞内容物。然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，再用研钵将其磨成粉。分离核DNA或细胞器DNA时则应采取更为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含有渗透剂的缓冲液中4匀浆的方法来破壁。其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子镁离子。最后，一旦DNA释放出来，实验过程中对其破坏的程度必须要降到最低，避免剧烈振荡或小孔Tip头快速抽吸溶液中的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为50-100kd的DNA。因为在DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过RNase A处理过后除去。但多糖类杂质一般比较难除去，此类杂质过多时，常常使提取物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍Southern杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响吸光度对核酸的定量分析等。方法 一实验仪器、材料与试剂（一）仪器1. 研钵2. 高速台式离心机3. 微量取液器4. 恒温箱5. 琼脂糖凝胶电泳系统（二）材料转基因拟南芥 （三）试剂试剂：CTAB1提取液（50mmol/L Tris- HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA， 0.7 mol/L NaCl）CTAB2提取液(50mmol/L Tris- HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA， 0.7 mol/L NaCl， 2%CTAB，40mmol/L -巯基乙醇0.2-0.3%体积的-巯基乙醇,巯基乙醇用前加)（四）实验步骤CTAB法小量提取植物基因组DNA(1) 取少量新鲜叶片，加入200L的CTAB1提取缓冲液研磨，磨碎后再加入200L的CTAB1提取缓冲液，再加入500L的CTAB2提取缓冲液，混匀，放在65 水浴锅中温育30min（温育过程中要不断的颠倒混匀溶液，动作要轻）；(2) 加入600L氯仿，均匀混合，动作要轻；(3) 13000r/min轻度离心5分钟；(4) 取上清，加入等体积的异丙醇，于- 20静置30min；(5) 12000r/min离心10min，弃上清，70%的乙醇洗涤两次，稍干燥，用30L灭菌的无离子水溶解（含有RnaseA）。思考题：植物基因组提取过程中那些操作环节会影响你所提取的DNA的质量和完整性？实验十二 转基因植物的PCR检测实验目的掌握PCR反应的原理及技术。实验原理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到1067个拷贝。PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1. DNA扩增仪（PCR仪）2. 台式离心机3. 微量取液器4. 硅烷化的PCR小管5. 琼脂糖凝胶电泳系统（二）材料模板DNA（三）试剂1. 10PCR buffer2. 4种dNTP混合物：每种10mmol/L 3. Taq DNA聚合酶：5u/l4. 引物1和2：10mol/L5. 琼脂糖凝胶电泳试剂 实验步骤1. 在0.2ml Eppendorf管内依次混匀下列试剂，配制50l反应体系。ddH2O 40.8 ul10PCR buffer（含MgCl2）5 uldNTPs（10mM）1 ul引物1 (10uM)1 ul引物2 (10uM)1 ul模板DNA1 ulTaq DNA 聚合酶（5u/ul）0.2 ulTotal Volume50 ul2. 按下述循环程序进行扩增94 3分钟，1个循环； 94 30秒，52 30秒，72 50秒，30个循环； 72 延伸10 分钟。 4保温。3. 扩增结束后取15l扩增产物利用琼脂糖电泳检测扩增情况及PCR产物的长度。实验十 -葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物实验目的学习GUS组织化学染色的方法，掌握染色的原理。实验原理-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）基因是植物转基因中常用的一个报告基因。GUS基