RP-HPLC-级管阵列检测器测定小蔓和大蔓长春花中的长春胺.pdf

R P H P L C 级 管 阵 列 检 测 器 测 定 小 蔓 和 大 蔓 长 春 花 中 的 长 春 胺 李平俞惟乐张仁斌周韵丽 中国科学院兰州化学物理研 究所 兰州 7 3 0 0 0 0 中国科学院上海药物研究所 2 0 0 0 3 1 提要 本文采用R P HP L C和二极管阵列检测器 建立了小蔓和大蔓长 春花中长春胺的快速 定性和定量测定方法 利用 HP L 保留 时间和二级管阵列检测器给出的紫外光谱进行定性 并 用半制备 HP L C 方法将长春胺收集纯化后用质谱和红外光谱加以确证 小蔓长春花中 的长 春胺 含量可直接从乙 醇萃取液中测 定 含量超过千分之五 大蔓 长春花中长春胺含量低于十万分之 一须经一次制备分离后才可测定 蔓长春花 V i n c a L 是一类有重要药 用价值的蔓生植物 在欧洲和中 东已 有悠久 的药用历史 长春胺 V i n c a m i n e 是蔓长 春花中的一个主要有药理活性的吲 胚 哚生物 碱睿现在已用于临床治疗高血压和脑血栓疾 病 1 2 蔓长春花植物主要包括有小蔓 长春 花 V i n c a m i n o r 和大蔓长春花 V i n c a m a j o r 等 主要分布在欧洲 西亚 中亚和北美等 温带地区 我国缺乏此类植物资源 中国医 学科学院北京药用植物资源开发研究所从欧 洲引种了小蔓长 春花 并用一般植物化学方 法对其中的长春胺进行了 鉴定3 关于我国 种植的大蔓长春花中的长春胺含量未见文献 报道 本工作是在研究吲哚生物碱H P L C 的最 佳分离条件的基础上4 应用半制备液相色 谱方法制备纯化长春胺 利用H P L C 保留时 间以 及 二极 管阵 列 检测 器给 出的 紫外 光谱初 步定性 最后用质谱和红外光谱进行鉴定 定量测定了小蔓和大蔓长春花中长春胺的含 量 实验部分 一 仪器和试剂 仪器M 6 0 0 0 A 输液泵 Wa t e r s Mi l f o r d MA U S A 7 1 2 5 六通进样阀 R h e o d y n e C o t a t i C A U S A H P 1 0 4 0 A 二极管阵列检测器 H e w l e t t P a c k a r d Wa l d b r o n n F R G 色谱柱 B o n d a p a k C 1 8 1 0m 3 0 0 3 9 m m I D 分析柱和 3 0 0 7 8 m m I D 半制备柱 试剂和样品 甲醇 紫外光学纯 上海 振兴化工厂 其它试剂均为分析纯 二氯 甲烷经一次重蒸后使用 小蔓长春花由中国 医学科学院北京药用植物资源开发研究所提 供 大蔓长春花由南京植物研究所提供 样品 预处理干燥的小蔓和大蔓长春花 地上部分 用9 5 乙醇7 0 浸泡三次 每次一 小时 浸泡液过滤后减压蒸馏得乙醇浸膏 用5 醋酸溶液 室温 浸泡浸膏 酸性浸 泡液用乙 醚抽提 除去其中脂溶性和中 性物 质后再用氨水调p H 值至9 然后用二氯甲烷 抽提三次 把二氯甲 烷抽干后得总生物碱 结果与讨论 根据早先的研究 吲哚生物碱在 B o n d a p a k C 1 8 柱上以 含中 性 磷 酸缓冲液的 甲醇为移动相可得最佳分离 故此 选用此 色谱条件分离测定小蔓和大蔓长春花中的活 性吲胚哚生物碱长春胺 一 小蔓长春花中长春胺的定性 图1 为小蔓长春花9 5 乙 醇萃取液的色 谱图 图中峰1 的保留 时间和紫外光谱与长春 胺标准样品完全相同 由此可以初步认为该 色谱峰就是长春胺 为了进一步确定图1 中 峰1 确为长春胺 在与图1 同 样的移动相组 成下换用半制备柱分离收集该成分 供进一 步的质谱和红外光谱鉴定用 此时必须注意 的是 虽然小蔓长 春花9 5 乙 醇萃取液可以 直接在分析柱上进行分离 但当用半制备柱 进行制备 分离时 由于进样量较大 而且萃 取液中含有大量叶绿素等杂质成分 它 们在 柱子中与移动相相遇后由于溶解度发生变化 会产生沉淀 容易造成柱子的污染和堵塞 为了 避免这一问题的 发生 可把乙 醇萃取液 处 理为 总生 物碱后 再 进行制 备 分离 所以 在 半制备柱上以总生物碱作为初始样品 将图 1 中峰 1 切割收集 收集液用提取总生物碱 方法处理后得到第一次制备物 将此制备物 进行纯度检查时看到在主要色谱峰 峰2 前仍有一个小峰存在 而且当用二级管阵列 检测器给出的紫外光谱对峰2 不 同部位进 行扫描时发现其峰前和峰顶处紫外光谱同长 春胺相同 而峰尾处的紫外光谱有 所不 同 图2 这说明峰2 的尾部仍包藏有其它 杂质成分 当换用含酸性磷酸缓 冲液 P H 2 3 的甲 醇为移动相分离此制备物时 这些 杂质成分同主要成分得到了 完全分离 这是 因为在不同p H条件下 生物碱的存在形式 不同 所以 色谱行为也有很大的改变 在中性 条件下有相似色谱行为的生物碱成分 在酸 性条件下其色谱行为可能会有差别 由此可 见 可以 改变移动相的p H 值而使复杂的生物 碱成分依次分开 在半制备柱上换用酸性缓 冲液进行第二次制备 所得产品经纯度检查 已为单一成分 该单一成分经质谱分析 测 得质量数为3 5 4 M 的 分子离子峰 整个质 谱图和红外光谱图同长春胺标样的 谱图完全 相同 由此证明收集到的成分确属长春胺 二 大蔓长春花中长春胶的定性 由于大蔓长春花9 5 乙醇萃取液的分析 结果表明 在长 春胺出峰位置没有明显的色 谱峰存在 所以将大蔓长春花9 5 乙醇萃取 液处理为总生物碱 以提高长春胺的相对含 量和除去非生物碱化合物 图3 为大蔓长春 花总生物碱的 H P L C分离 从图中可见在 长春胺保留 羰 时间也有一个小峰存在 峰1 但其紫外光谱与长春胺不同 所以难以断定 大蔓长春花中是否有长春胺存在 故此有必 要将图3中同长 春胺保留时间相同的的色谱 峰 峰1 进行制备浓缩 以便进一步分 离 和鉴 定 按 照图3 的 移动 相 条件在 半制 备 柱上收集峰 1 收集液经减压浓缩后进行纯 度检查 从图4 可见 此制备物在分析柱上 用不同 移动相条件分析 仍得到与长 春胺标 准样品 保留时间相同 对称性很好的单一色 谱峰 但此峰的紫外光谱与长春胺不同 此 时可按照一般色谱制备原则进行分离 即 对 于微量或极难分离的组分 可以采用先经制 备HP L C 分离和浓缩 再经半制备HP L C 进 行分离纯化 最后用高柱效的 分析柱在样品 不超负载的情况下分离精制 可得到纯品5 故换用高柱效的分析柱对大蔓长春花半制备 柱收集物进行分离 此时从该制备物中 分离 出七个以上成分 图5 而且其中 峰2 的 保 留时间和紫外光谱与长春胺标准样品相同 在此条件下收集峰2 后再进行纯度检查时得 到单一色谱峰 该峰的紫外光谱 质谱图与 长春胺标准样品的谱图完全相同 由此证明 大蔓长春花中有长春胺存在 但含量很低 从大蔓长春花中长春胺的定性可 以看 出 如果仅仅依靠不同色谱条件下的保留时 间和峰形来定性 特别 是在色谱柱效不够高 时 是不可靠的 如果利用紫外光谱进行辅 助鉴定 则可极大地提高定性的可靠性 三 小蔓和大蔓长春 花中长春胺的定 量 由于小蔓长春花和大蔓长春花 分别属于长春胺含量极高和极低的 两类植物样品 有必要研究建立对 它们分别适用的定量方法 从图1 可知小蔓长春花中的长 春胺可直接 从其9 5 乙 醇萃取液中测定 经计 算得知此时长春胺色谱峰的纯度高 于9 5 而对于大蔓长春花来说 由 于其中长 春胺含量极低 而且和 其它成分不易分离 须经制备成总 生物碱及一次半制备 HP L C分离收集使长 春胺浓缩后才可用来测定 如图5 所示 精确 配制 六个 不同 浓 度的长 春 胺标准 溶 液 以1 0 微升贮样环进样 在图5 所示色谱 条件下测定长春胺含量同峰高的关系 经线 性回归得长春胺量同峰高的关系为 Y 0 0 0 7 01 5 2 X 相关系数0 9 9 9 8 在标准曲线测定的同样条件下 测定了 小 蔓长春花9 5 乙 醇萃取液中长春胺的含 量 测得小蔓长春花中长春胺含量高于千分 之五 将大蔓长春花9 5 乙 醇萃取液制成总 生物碱后在半制 备柱上制备收集与长春胺有 相同 保留时间的成分 收集液浓缩后进行定 量测定 测得大蔓长春花中长春胺含量低于 十万分之一 结论 用反相H P L C 方法研究建立了活性吲哚 生物碱长春胺含量较高和较低植物样品的定 性定量测定方法 小蔓和大蔓长春花中的长 春胺在 B o n d a p a k C 1 8 柱上以含中性磷酸 缓冲液的甲醇为移动相时可得最佳分离 通 过用H P L C 分离制备 经标准样品的保留时 间 紫外光谱 质谱和红外光谱对照进行定 性鉴定 确保了所建立方法的可靠性 小蔓 长春花中长 春胺可直接从9 5 乙 醇萃取液中 测定 含量高达千 分之五以上 大蔓长春花 中长春胺含量低于十万分之一 须经一次制 备浓缩后才可测定 致谢 对中国惠普公司提供HP 1 0 4 0 A 检测 器 中国医学科学院北京药用植物资源开发研究所 提供小蔓长春花 南京植物研究所提供大 蔓长春 花 在此表示衷心感谢 参考文献 1L S z p o r n y A c t a P h a r m a c o l 2 9 8 7 1 9 7 7 2 W I T a y l o r N R F a r n s w o r t h e d T h e V i n c a A l k a l o i d s N e w Y o r k M a r c e l D e k k e r P 1 8 7 1 9 7 3 3 樊 瑛 杨 春清 杜成 刚 中 草药 1 8 3 3 6 1 9 8 7 4 李 平 张仁斌 俞惟乐 周韵丽 药学学报 2 4 3 2 1 2 1 9 8 9 5 K H o s te t t m a n n e t a l e d P r e p a r a t i v e C h r o rm a to g r a p h T e c h n i a u e s A p p l i c a t i o n s i n Na t u r a l P r o d u c t I s o l a t i o n B e r l i n S p r i n g e r V e r l a g P 5 6 1 9 8 6 收稿日 期 1 9 8 9 年3 月8 日 D e t e r m i n a t i o n o f V i n c a m i n e i n V i n c a M i n o r a n d V i n c a M a j o r b y R e v e r s e d p h a s e H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y w i t h P h o t o d i o d e A r r a y D e t e c t o r L i P ng a n d Y u We i l e L a n a h o u I n s t i t u t e o C h e m i c a l P hs i c s A c a d e m i a S i n i c a 7 3 0 0 0 Z h a n g Re n b ig a n d Z h o u Y u n l i S h a n g h a I n s t i t u t e o f Ma t e r i a Me d i c a A c a d e m i a S i n i c a 20 0 0 3 1 A r a p i d m e t h o d f o r t h e s e p a r a t i o n a n d d e t e r m i n a t i o n o f v i n c a m i n e i n V i n c a m i n o r a n d V i n c a m a jo r b y r e v e r s e d p h a s e h i g h p e r fo r m a n l iq u id c h r o m a to g r a p h y R P H P L C u s in g a p h o t o d i o d e a r r a y d e t e c t o r h a s b e e n d e v e l o p e d o n B o n d a p a k C1 8 c o l u mn wi t h me t h a n o l a n d p h o s p h a t e b u f f e r s o l u t io n a s t h e m o b i le p h a s e I n o r d e r t o c o n f ir m t h c o m p o n e n t s e p a r a te d f r o m t h e to ta l a l k a lo i d t h e p e a k c o n t a i n i n g v i n c a m i n e w a s c o l l e c t e d b y a s e m i p r e p a r a t i v e c o l u m n a n d t h e n c o r r o b o r a t e d b y MS a n d I R T h e c o n t e n t o f v i n c a m i n e w a s d e t e r m i n e d d i r e c t l y f r o m t h e e t h a n o l e x t r a c t o f t h e p l a n t V i n c a m i n o r T h e c o n c e n t r a t i o n o f v i n c a m i n e i n V i n c a m i n o r p l a n t e d i n C h i n a i s a b o u t 0 5 O w i n g t o t h e v e r y l o w c o n t e n t l e s s t h a n 0 0 0 1 o f v i n c a m i n e i n V i n c a m a j o r t h e v i n c a m i n e w a s p r e c o n c e n t r a t e d w i t h a s e m i p r e p a r a t i v e c o l u m n a n d t h e n d e t e r m i n e d b y t h e s a m e p r o c e d u r e a s u s e d f o r Vi n c a m i n o r F O U R T H A S I A N C H E M IC A L C O N G R E S S 第 四 届 亚 洲 化 学 大 会 通 知 在2 1 个国家与 地区的化学会所组成的亚洲化 学学会 联合会的倡议下 得到国家科委 中国科协 国家自 然科学基金 委员会 中国科学院和联合国教 科文组织的支持 中国化学会将于1 9 9 0 年8 月2 6 3 0 日 在北京国际会议中心 亚运村 主 办 第四 届 亚 洲 化 学 大 会 4 A C C 会 议 的 主 题为 化 学 在 提 高 人 类 健 康 状况 与 生 活 水 平中 所 起 的 作用 大会 不 仅 有 亚 洲国家 还有北美 西欧诸国的化学家参加 届时组织委员会还将邀请国际上有名望的化学家作大会与专题报告 这次 大会是 在我国召 开的亚洲 地区 化学界的一次 盛会 我们 欢迎中国 化学家参 加大会 一 会议设十个专题 1 天 然 产 物 有 机化 学 2 分 析 化 学 和分 析 仪器 包 括色 谱分 析 3 环 境 化 学 4 农 业化 学 5 配 位 化 学 及 其 在 医 药 农业方面的应用 6 高分 子科学 7 光化学 8 化学教育 9 计 算机在化学中的应用 1 0 催化 会议还将组织展览 会 除了请国内外 厂商参展外 还将组织我国的技术展出 二 我国代表参加会议的有关事项通知如下 1 欲 参 加会 议 者 须 于 1 9 9 0 年6 月 3 0 日 以 前 报 名 报名 单 中 的 内 容 应包 括 姓 名 性 别 工 作 单 位 年 龄 职称 电 话 通 讯地 址 邮 政 编 码 参 加 组 别 口 讲或 墙 报展 讲 任 选 其 一 下 转1 6 5 页 在对交联有阻碍作用 随着固定液中苯基和 氰丙基的增加 交联难度加大 通过增加O 3 表 4 取 代基不同的固定液交 联条件比 较 量 升高交联温度及增加交联次数 可得到 较高交联效率 用研制O V 1 7 0 1 交联弹性毛细管柱分析 结核分枝杆菌中的脂肪酸甲 酯见图4 桔子 皮油及沸点高 组分复杂的枣精等样品 在 该柱上也均可取得满意的分离结果 参考文献 1 J B u i j t e n L B l o m b e r g S H o f f m a n n K M a r k i d e s T Wa n n m a n J C h r o m a t o g r 2 8 3 3 4 1 1 9 8 4 2 J B u i j t e n L B l o m b e r g S H o f f m a n n K M a r k i d e s T Wa n n m a n J C h r o m a t o g r 2 8 9 1 4 3 1 9 8 4 3曾 昭睿 吴采樱 周雪梅 色 谱 6 4 2 0 0 1 9 8 8 4 K A A n d r i a n o v M e t a l o r g a n i c P o l y m e r s I n t e r s c i e n c e N e w Y o r k P 5 9 1 9 6 5 收 稿日 期 1 9 8 9 年3 月1 8 日 P r e p a r a t i o n o f O V 1 7 0 1 C r o s s L i n k e d F u s e d S i l i c a C a p i l l a r y C o l u m n b y O z o n e C u r i n g M e t h o d a n d I s E v a lu a t io n Z e n g Z h a o r u i W u C a i y i n g Ha n H u i m i n a n d Z h o u Xi c h u n D e p a r t m e n t o C h e m i s t r y Ui v e r s i t y o Wu h a n 4 3 0 0 77 2 M e d i u m p o l a r s t a t i o n a r y p h a s e O V 1 7 0 1 h a s b e e n s u c c e s s f u l l y i m m o b i l i z e d o n f u s e d s i l i c a c a p il la r y T h e s t u d y s h o w e d t h a t t h e s e p a r a t io u n e f f i c i e n c y t h e t h e r m a l s t a b i l i t y a n d t h e c r o s s l i n k i n g e f f i c i e n c y w e r e g o o d A f t e r o z o n e t