观察大鼠脑神经元c-Fos蛋白表达的方法.doc

实验46 观察大鼠脑神经元c-Fos蛋白表达的方法【目的要求】1. 学会用免疫组织化学技术显示脑神经元中c-Fos蛋白表达的方法。2. 了解脑内神经元c-Fos蛋白表达的特点。【基本原理】c-Fos蛋白是即刻早期基因c-fos转录翻译的产物，是一种核内磷酸化蛋白。基础状态下，c-Fos蛋白在中枢神经系统的水平非常低，然而各种应激状态下，c-Fos蛋白的表达能够被瞬时快速地诱导。中枢神经系统内c-Fos蛋白的表达依赖于应激源的内在特性、强度和持续时间。由于c-Fos蛋白的诱导表达能在很大程度上反映应激诱导的神经元活动情况，故其常被作为神经元激活的标志，并广泛用于示踪特定条件下的神经功能通路。实验中应用免疫学抗体与抗原特异性结合的原理识别c-Fos蛋白，并通过与抗体相联接的酶催化底物改变颜色使之显示出来，从而对其进行定位和半定量研究。大鼠不同脑区c-Fos蛋白的表达程度反映了神经元激活的空间模式。【材料与器械】大白鼠、常用手术器械、冰冻切片机、显微镜、24孔或48孔培养板或称量瓶（2530）、移液器（10 L、100 L、200 L、1000 L）、移液器枪头（10 L、200 L、1000 L）、滴管、粘片剂处理的载玻片、盖玻片、小毛笔、染色缸、2%戊巴比妥钠、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PB，pH7.4）、0.01 mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（PBS，pH7.4）、4多聚甲醛（0.1 mol/L PB配制）、20%蔗糖（0.1 mol/L PB配制）、防冻液（丙三醇：乙二醇：PBS = 2：3：5）、OCT包埋剂、3%过氧化氢/甲醇溶液、10%正常羊血清或牛血清白蛋白、30%Triton X-100、兔抗大鼠c-Fos抗体、生物素化羊抗兔IgG、链亲和素辣根过氧化物酶复合物、DAB显色液、Mayers苏木精染液、梯度酒精（75%、95%、100%）、二甲苯、中性树胶。【实验步骤】1. 麻醉大鼠2%戊巴比妥钠（100 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。2. 脑组织的固定及脱水处理左心室穿刺至主动脉升部，先灌流0.01 mol/L PBS约200 mL，快速冲洗血液，随后灌注冷的4多聚甲醛约400 mL，先快后慢，持续约1 h。取脑后，将其置于4%多聚甲醛（4）后固定46 h，或储存过夜。然后将脑组织置于20%蔗糖（4）中脱水，至脑沉底。若要较长时间保存脑组织，脱水后，放入防冻液中，存于-20冰箱。3.冰冻切片用OCT包埋剂包埋脑组织，将其固定在冰冻切片机的载物台上，-20冰冻30 min。然后开始做连续恒冷冠状切片，脑片厚2040 m。切片按需要分部收集于0.01 mol/L PBS中。通常收集三套切片：第一套切片进行c-Fos免疫组织化学反应；第二套切片用于免疫组化阴性对照实验；第三套切片中性红或焦油紫染色，用于核团定位。4. 阻断内源性酶活性漂浮的脑切片先用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min（以35 min表示，下同）。随后，3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30 min。之后，PBS充分漂洗，35 min。5. 封闭处理5%正常羊血清或2%牛血清白蛋白（含0.3% Triton X-100）室温孵育脑切片30 min。孵育完成后，吸出封闭液，勿冲洗。6. 一抗（兔抗大鼠c-Fos抗体）孵育兔抗大鼠c-Fos抗体（1：2000，sc-52，Santa Cruz Biotechnology Inc，USA）（含0.3% Triton X-100和3%正常羊血清）37孵育24 h或4孵育过夜。阴性对照脑切片，用PBS、正常羊血清或牛血清白蛋白代替一抗孵育。孵育完成后，0.01 mol/L PBS充分漂洗，35min。7. 生物素化二抗孵育适度稀释的生物素化羊抗兔IgG（含0.3% Triton X-100和3%正常羊血清) 常温孵育1 h，0.01 mol/L PBS充分漂洗，35min。7. 酶标试剂检测适度稀释的链亲和素辣根过氧化物酶复合物（含0.3% Triton X-100）常温孵育1 h，0.01 mol/L PBS充分漂洗，35min。8. DAB显色DAB显色液处理脑切片35 min，0.01 mol/L PBS漂洗终止显色反应。9. 贴片、复染和封片脑切片充分漂洗后，贴片，略干。苏木精染液轻度复染（必要时），自来水冲洗，自然干燥，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。10. 显微镜下观察或用图像分析系统对实验结果进行分析处理。c-Fos阳性神经元的细胞核呈棕黄色或棕褐色，而阴性神经元的细胞核呈蓝紫色（图46-1）。图46-1束缚-浸水应激60 min诱导的大鼠脑干孤束核中c-Fos蛋白的表达（400）【注意事项】1. 大鼠脑组织在冰冻切片前必须在蔗糖溶液内浸泡，直至沉底，因为冰冻过程中组织和细胞内形成的冰晶对神经元结构有破坏作用。2. 抗体在使用前应先摸清其效价和最适稀释度。理想的稀释度应是，抗体稀释度达到最高，阳性结果清晰可见，而背景无色。3. 一般可用0.01 mol/L PBS（pH7.4）作为抗体稀释液，但不宜存放过久。如欲久置则应以Tris-HCl缓冲液（pH7.6）稀释抗体。4. 配好的抗体工作液保存于4，切忌反复冻融。5. 免疫组化染色必须要有严格的对照，尤其是阴性对照，以排除假象。6. 注意正常羊血清封闭处理后，不可漂洗脑切片。7. PBS漂洗脑切片要充分，且漂洗的PBS为一次性，防止交叉污染。8. 复染时间不宜过长，否则影响抗原的观察。【思考题】1. 大鼠脑神经元内c-Fos蛋白表达的特点有哪些？2. 为什么c-Fos蛋白的诱导表达被广泛用作神经元激活的标志？【参考文献】郭云良，姚维成，高焕民，范振芹. 2005. 神经生物学技术. 青岛: 中国海洋大学出版社Kovacs KJ. 1998. c-Fos as a transcription factor