薄层色谱-光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量.pdf

第 4卷第 3期 2 0 0 4年9月 中 国 食 品 学 报 J o u rna l o f C h i n e s e I n s t i t u t e o f F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y Vo 1 4 No 3 S e p 2 0 0 4 薄层色谱一 光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量 王 江海 袁建 平 徐世平 刘 昕 中山大学国家教育部食品工程研究中心 广州 5 1 0 2 7 5 摘要灵芝 三萜类 化合 物是 灵芝孢 子 油 中的 主要 功 效成 分 本文提 出 了一 种测 定灵 芝孢 子 油 中总三 萜含 量 的可靠方法 即薄层 色谱 T L C 一 光度法 该测定方法能 住确测定灵芝孢子油样品 中的总三萜含量 且其准 确度明显高于直接光度法 实验结果显示 直接光度法的测定结果具有明显的正偏差 关键词 灵芝孢子油 总三萜 薄层 色谱一 光度法 文章编 号1 o o 9 7 8 4 8 2 0 0 4 0 3 0 0 7 6 0 4 灵芝孢 子油是采用先 进的超 临界二氧化碳 流 体萃取技术从破壁的灵芝孢子中萃取得到的油状 脂 质物 目前在 灵芝 和灵芝孢 子油 中已发 现 1 2 0 多种灵芝三萜类化合物 因其化学结构的多样性 而具有广泛的药理活性 l o l 最新的研究表明 灵芝孢子油中的脂质活性物质具有显著的抑制肿 瘤I1 1 12 和抗艾滋病毒的活性 1 近年来 灵芝孢 子油产品 已成为高档保健 品中的珍品 高效液相色谱法 H P L C 和薄层色谱 T L C 一 液相色谱 质谱 L C M S 法是测定灵芝孢子油 中三萜类化合物和总三萜含量准确有效的分析方 法 由于获得高纯度的灵芝孢子三萜类化合物 标准品的技术难度大 目前仅为极少数研究机构 所掌握 总三萜含量的常规测定方法是以熊果酸 等 三萜类 化合物 为对 照品 用 冰醋 酸一 香 草醛 和 高氯酸为显色剂 用光度计直接测定总三萜的含 量 该 方法 已被用于不 同灵芝 中总三萜 含量 的 测定 然而 当采用上述方法直接测定灵芝孢 子油中总三萜含量时 由于出现较强的干扰 其 结果存在明显的正偏差 利用薄层色谱法或快速 柱层 析 F C C 法 对 灵 芝 孢 子 油 样 品进 行 预 分 离 可以基本排除其它组分对测定的干扰 为此 本文用薄层色谱一 光度法测定灵芝孢子油中总三 萜 的含 量 收稿 日期 2 0 0 4 0 1 1 8 作者简介 王江海 男 1 9 6 5年出生 教授 1 实验材料和方法 1 1 试剂和药品 熊果酸标准品由中国药品生物制品检定所提 供 薄层层析板为天津市天河医疗仪器公司产 品 高氯酸 分析纯 为天津市西青鑫源化工厂 产品 冰醋酸 分析纯 二氯 甲烷 分析纯 甲醇 分析纯 三 氯 甲烷 分析纯 和石油 醚 分析 纯 等 为汕头西 陇 化工 厂产 品 乙酸 乙酯 分析纯 为 中国医药上 海化学试剂公司产品 1 2灵芝 孢子油样品 l I2 1 灵芝孢子油产品 萌动激活纯灵芝孢子油 I I N G Z HI MAS T E R 由深圳 学 者 生物 有 限公 司 提供 从 国 内和香港 购得两个 品牌 的灵芝孢子 油 产品 茶油为市售 作为分析对照品 1 2 2 灵芝孢 子脂质提取物称取 由中山大学 国 家教育部食品工程研究中心提供的破壁灵芝孢子 原 料 l 8 5 5 4 3 g 置 于 1 0 0 mL 甲 醇 一二 氯 甲 烷 1 3 混合 溶 剂 中 超声 振 荡 3 0 mi n后 进 行过 滤 残 渣再 以 1 0 0 mL混合 溶 剂提 取 并 按此 实 验步骤重复提取 4次 超声振荡 和提 取 4次后 的残 渣再用索 氏抽提 器抽提 并以三氯甲烷为溶剂抽提 7 2 h 合并上 述所有的提取液 在 5 0 C温度下减压旋转蒸馏 以除去溶剂 得到浅金黄色油状的灵芝孢子脂质 提取物 1 3 测定方法 l 3 1 标准 曲线 的绘制 取 熊果 酸标 准 1 1 5 mg 维普资讯 第4 卷 第3 期 薄层 色谱一 光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量 溶于 1 0 0 0 m L乙酸乙酯 中 混合均匀得标 准溶 液 分 别 吸 取 O 0 0 O 1 O O 2 O 0 4 0 0 6 0 O 8 O 1 0 0和 1 2 0 mL标 准 溶 液 在 1 0 0 C水 浴 上蒸干后加入 0 4 0 m L 5 香草醛一 冰乙酸溶液和 1 0 0 mL高氯 酸 于 6 O C水 浴 中加 热 1 5 mi n后移 入冰 水浴 中 再 加入 5 0 0 mL冰乙酸 摇 匀 后置 于室温 1 5 mi n后用 分光 光度计 在 5 4 8 1 n m 波长 下测定其吸光度 根据测定结果绘制标准曲线 1 3 2 直接光 度法 测定 取灵 芝孢子油样 品 5 0 0 1 0 O O mg 溶 于 1 0 0 0 mL乙酸乙酯 中 分别 吸取 一 定体积 的该 溶液 在 1 0 0 C水浴上蒸 干后 加入 0 4 0 mL 5 香草醛一 冰乙酸溶液和 1 0 0 m L高氯 酸 于 6 O C水 浴加 热 1 5 m i n后 移 入 冰 水 浴 中 再加 入 5 0 0 mL冰 乙酸 摇 匀后置 于室 温 1 5 mi n 后 用分 光光 度计 在 5 4 8 1 n m 波长 下 测定样 品溶 液 的吸光度 1 3 3 T L C 一 光 度法 测 定 用 减 重法 称取 一 定 量 样品 溶于少量乙酸乙酯中 点样于活化硅胶 G 板 2 0 c mx 2 O c mx O 2 5 c m 上 以熊果酸标准品 作参 比 用石油醚一 乙酸乙酯 9 5 5 展开 R f 值为 0 6 1 O的部分为甘油酯 R f 值为 O O 6的 部分为三 萜类化合物 用乙酸乙酯洗 脱 氮气 吹 干 分别称重 取 含三萜 类化 合物 部分 R f 值 为 O O 6 2 O O 1 0 O O mg 溶 于 2 0 0 2 5 0 mL乙 酸 乙 酯 中 分别吸取一定体积的该溶液 在 1 0 0 C水浴上蒸 干 后 加 入 0 4 0 mL 5 香 草 醛 一冰 乙 酸 溶 液 和 1 0 0 m L高氯酸 于 6 O C水浴加热 1 5 m i n后移入 冰水浴 中 再加 入 5 0 0 mL冰 乙酸 摇匀 后置 于 室 温 1 5 mi n后用 分光 光度计 在 5 4 8 1 n m 波长 下 测定样品溶液的吸光度 2 结果与讨论 灵芝孢子油 中三萜类化合物种类超过 1 2 0 种 分离获得高纯度 具有代表性的灵芝三萜类 化合物标准品技术难度大 为建立具有普适性的 测定方法 仍以 自然界广泛存在的三萜类化合物 熊果酸为对照品 采用薄层色谱分离与光度法测 定相结合的分析方法测定灵芝孢子油中的总三萜 含量 并 与直接 光度法 测定的结果进 行 比较 图 1是以熊果酸为对照品 冰醋酸一 香草醛及高氯 酸为显色剂 测得的标准品重量 m g 与吸光度 值之间关系的标准曲线 从图 1 看出 标准品重 量在 O O 1 4 m g 范围内与吸光度值呈良好的线性 关系 其线性 回归方程为 y O 1 4 0 6 x 0 0 0 2 4 相 关 系数 r O 9 9 8 6 吸光度 图 1 光度法测定三萜类化合物的标准曲线 F i g 1 S t a n d a r d e u l v e o f t h e t r i t e r p e n o i d s d e t e r mi n e d b y s p e c t r o p h o t o me t r i c me o d 表 1列 出 了采用两种 测定方法对几 种灵芝孢 子油样 品中总三萜 含量 的测定结果 从表 1可 以看 出 直 接光 度 法 和 T L C 一 光度 法 的测 定 结果 有很大 的差 别 用直接光 度法测 出的灵芝孢 子油样 品 中总 三萜的含量 明显偏 高 甚 至茶 油对 照品 中总三萜含量的测 定结果也 高达 1 6 2 7 这显然与实际不符 采用薄层色谱法对各种灵芝 孢子油样品的组分分离实验表明 灵芝孢子油中 的甘油三脂总量一般高于 8 0 因此 灵芝孢子 油中的总 三萜含量不可能超过 2 0 由于灵 芝孢 子油中的油脂及其它组分对灵芝三萜类化合物含 量 的测定 产生 明显 的干扰 从 而使 直接光度法 测 定灵芝孢子油中总三萜含量出现显著的正偏差 因此表 明不能直接采用 光度法测定 灵芝孢子油样 品中总三萜的含量 而应当在测定前将灵芝孢子 油中的甘油三脂及溶于其 中的其它可能对总三萜 含量测定造成干扰 的组分分 离除去 通过本实验 建立 了用 于准确测定灵芝孢 子油 中总三 萜含 量 的 T L C 一 光度 法 即在用光 度法 测 定灵芝孢子油中总三萜的含量前 先用薄层色谱 维普资讯 7 8 中 国 食 品 学 报 2 0 0 4 年 第3 期 法将样 品中的三萜类化合 物与其 它组 分尽可 能分 离 在排除其 它组分 干扰后再用 光度法测定 总三 萜 的 含量 从表 1看 出 采用 T L C一 光 度法 所得 到的结 果合 理 准确 该 方法 的 回收率 为 9 6 4 1 0 3 8 标准偏差小于 3 灵芝三萜类化合物的结构非常复杂 并带有 多种功能基团 其中约 5 0 的灵芝三萜类化合物 为带羧基的三萜酸 故灵芝孢子油的酸性 比普通 食用 植物油强 若 采用食用 油的酸价指标评 价孢 子 油 的 品 质 则 灵 芝 孢 子 油 的 酸 价 高 达 1 5 m g K OH g以上 远 高 于 国 家一 级食 用 植物 油 的酸 价 指标 1 0 mg KO H g 因此 酸 价 指标 不 仅 不能用来评价富含灵芝三萜等活性成分的灵芝孢 子油的品质好坏 而且也不能按食用植物油的质 量标准及工 艺生产灵芝孢 子油 否则 会将其功 效 降至 比食用植 物油更低 如 在香港市场上 购买 的 经精炼 的 色泽浅 味道 淡 酸价低 的某 品牌灵 芝 孢 子 油 其 总三 萜 含 量 仅 为 2 左 右 见 表 1 略高于茶油中的总三萜含量 表明该灵芝孢 子油产品中的绝大部分活性成分在精炼时已被除 去 基本丧失了灵芝孢子油原有的药用价值 分 析结 果还 表 明 见 表 1 从 萌 动激 活 灵 芝孢子中萃取得到的纯灵芝孢子油 其总三萜含 量高达 1 0 3 6 因而具有很高的药理活性 在 实验室 条件 下从新鲜 破壁灵 芝孢子 中提取 的灵芝 孢 子脂 质 其总 三萜 的含量达 9 5 7 略低 于萌 动激活纯灵芝孢子油 上述实验结果表明 将休 眠的灵芝孢子进行萌动激活可显著提升其药理活 性 参 考 文 献 1 E l M e k k a w y S M e s e l h y M R N a k a m u r a N e t a 1 A n t i H I V l a n d a n t i H I V l p r o t e a s e s u b s t a n c e s f r o m G a n o d e r ma l u c i d u m J 1 P h y t o c h e mi s t r y 1 9 9 8 4 9 6 1 6 5 1 1 6 5 7 2 Mi n B S Na k a mu r a N Mi y a s h i r o H e t a 1 Tfi t e r p e n e s f r o m t h e s p o r e s o f Ga n o d e r ma l u c i d u m a n d t h e i r i n h i b i t o R a c t i v i t y a g a i n s t H t V 1 p r o t e a s e I J 1 C h e mi c a l P h a r ma c e u t i c a l B u l l e t i n 1 9 9 8 4 6 1 6 0 7 1 6 1 2 3 S u C Y S h i a o M S W a n g C T P o t e n t i a t i o n o f g a n o d e rm i c a c i d S o n p r o s t a g l a n d i n E l i n d u c e d c y c l i c AMP e l e v a t i o n i n h u ma n p l a t e l e t s J T h r o mb o s i s R e s e a r c h 2 0 0 0 9 9 2 l 3 5 l 4 5 4 n S B C H L e e S S e t a 1 Tfit e r p e n e e n fi c h e d e x t r a c t s f r o m Ga n o d e r ma l u c i d u m i n h i b i t g r o w t h o f h e p a t o ma c e l l s v i a s u p p r e s s i n g p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i n g mi t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e s a n d G2 p h a s e c e l l c y c l e a r r e s t J L if e S c i e n c e s 2 o 0 3 7 2 2 1 2 3 8 l 2 3 9 0 5 Z h u M C h a n g Q Wo n g L K C h o n g F S e t a 1 T r i t e r p e n e a n t i o x i d a n t s f r o m G a n o d e r ma l u c i d u m J P h y t o t h e r a p y R e s e a r c h 1 9 9 9 1 3 5 2 9 5 3 l 6 Ni s h i t o b a T S a t o H S a k a mu r a S N e w t e r p e n o i d s f r o m G a n o d e r ma l u c i d u m a n d t h e i r b i t t e r n e s s J A c u l t u r a l a n d Bi o l o g i c a l Ch e mi s t 1 9 8 5 4 9 l 5 4 7 l 5 4 9 7 S h i a o M S L i n L J T w o n e w t r i t e r p e n e s o f t h e f u n g u s G a n o d e rma l u c i d u m I J 1 J o u rna l o f N a t u r a l P r o d u c t s 1 9 8 7 5 0 8 8 6 8 9 0 8 Wa n g C N C h e n J C S h i a o M S e t a 1 T h e i n h i b i t i o n o f h u ma n p l a t e l e t f u n c t i o n b y g a n o d e rmi c a c i d S l J lJ B i o 维普资讯 第4 卷 第3 期 薄层 色谱一 光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量 c h e m i c a l J o u r n a l l 9 9 l 2 7 7 1 8 9 1 9 7 9 Mi z u s h i n a Y Ta k a h a s h i N Ha n a s h i ma L e t a 1 L u c i d e n i c a c i d O a n d l a c t o n e n e w t e r p e n e i n h i b i t o r s o f e u k a r y o t i c D N A p o l y m e r a s e s f r o m a b a s i d i o m y c e t e G a n o d e r ma l u c i d u m f J 1 B i o o r g a n i c Me d i c i n a l C h e m i s t r y 1 9 9 9 7 2 0 4 7 2 0 5 2 l 0 罗俊 林志彬 灵芝三萜类化合物药理作用研究进展 f J 1 药学学报 2 0 0 2 3 7 7 5 7 4 5 7 8 l 1 Zh u H S Ya n g X L W a n g L B e t a 1 Eff e c t s o f e x t r a c t s f r o m s p o r o d e r m b r o k e n s p o r e s o f Ga n o d e r ma l u c i d u m o n He L a c e l l s J 1 C e l l B i o l o g y T o x i c o l o gy 2 0 0 0 1 6 2 0 1 2 0 6 l 2 L i u X Y u a n J P C h e n X J A n t i t u mo r a c t i v i t y o f t h e s p o rod e r m b rok e n g e r m i n a t i n g s p o r e s o f Ga n o d e r m a l u c i d u m C a n c e r L e t t e r s 2 0 0 2 l 8 2 8 l 5 5 l 6l l 3 马林 吴丰 陈若芸 灵芝三萜成分分析 I J 1 药学学报 2 0 0 3 3 8 1 5 0 5 2 l 4 王文祥 颐振纶 比色法测定山楂总三萜酸的含量 J 1 中国野生植物资源 2 0 0 3 2 0 5 4 7 4 8 1 5 赵明文 王晨光 鲍鹏等 不同灵芝菌丝体中三萜与多糖含量的比较 f J 1 中国食用菌 2 0 0 3 2 2 2 4 3 4 6 De t e r mi n a t i o n o f To t a l Tr i t e r p e n o i d s i n Ga n o d e rm a S p o r e Li p i d s b y t h e TLC S p e c t r o p h o t o me t r y Me t h o d Wa n g J i a n g h a i Y u a n J i a n p i n g Xu S h i p i n g L i u X i n F o o d E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t e r o f S t a t e E d u c at i o n M i n t O S u n Y at S e n U n i v e r s i t G u a n g z h o u 5 1 0 2 7 5 Ab s t r a c t Tr i t e r p e n o i d s a r e t h e ma i n e f f i c a c i o u s i n g r e d i e n t s i n g a n o d e rm a s p o r e l i p i d s I n t h i s p a p e r a s i mp l e a n d r e l i a b l e me t h o d t o d e t e rm i n e t h e c o n t e n t o f t r i t e r p e n o i d s i n g a n o d e r ma s p o r e l i p i d s b y the thi n l a y e r c h roma t o g r a p h y TL C 一 s p e c t r o p h o t o me t ry wa s p r o d u c e d T h e i n v e s t i g a t i o n s s h o we d t h a t t h e s p e c t r o p h o t o me t r y c o mb i n e d wi t l the T L C s e p a r a t i o n i s w e l l s u i t a b l e t o a c c u r a t e l y d e t e rm i n a t e t h e c o n t e n t o f t o t a l t r i t e r p e n o i d s i n g a n o d e r ma s p o re l i p i d s a mp l e s T h e a c c u r a c y o f t h i s me t h o d i s b e t t e r t h a n t h a t o f t h e di r e c t s p e c t r o p h o t o me t r y Th e l a t t e