酿酒酵母木糖代谢工程中辅酶.doc

酿酒酵母木糖代谢工程中辅酶工程的研究进展*摘要辅酶工程（cofactor engineering）是代谢工程的一个重要分支，它通过改变辅酶的再生途径，达到改变细胞内代谢产物构成的目的。介绍了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)木糖代谢工程中，利用辅酶工程解决氧化还原平衡问题的研究进展，包括引入转氢酶系统，增加代谢中可利用的NADPH，实现NADH的厌氧氧化等策略。同时介绍了改变XR、XDH辅酶偏好的研究进展。关键词:辅酶工程 木糖酒精 酿酒酵母 氧化还原辅酶工程（cofactor engineering），是代谢工程的一个重要分支。利用分子生物学技术，改造细胞内代谢途径，实现细胞内辅酶的再生1，改变辅酶氧化还原态的比率，从而改变细胞的代谢功能及氧化还原酶催化的产物构成。随着代谢工程的广泛应用，代谢流改造过程中目标产物得率不高，副产物积累的问题日趋显现，其产生的原因之一就是代谢网络的辅酶氧化还原的不平衡，为此在代谢工程研究过程中，必须对微生物代谢网络结构和功能进行准确分析，在改变代谢途径的同时，要考虑整个代谢过程的平衡，尤其是辅酶的平衡。根据代谢工程（Metabolic Engineering）原理，利用分子生物学技术，拓展传统乙醇生产菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的发酵底物，以最终实现木质纤维原料发酵生产酒精，是随着燃料乙醇广泛推广应用，而备受关注的问题之一。木糖是木质纤维水解液中含量仅次于葡萄糖的单糖。酿酒酵母由于缺乏转化木糖为木酮糖的酶系，不能利用木糖，但能利用其异构体木酮糖。木糖异构酶（xylose isomerase, XI）可以催化木糖形成木酮糖，目前只有来源于嗜热古菌Thermus thermophilus2及低等真菌Piromyces sp3的木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中得到了活性表达。多年来，在酿酒酵母中建立木糖向木酮糖转化途径的工作，主要是通过引入树干毕赤氏酵母（Pichia stipitis）的木糖还原酶(xylose reductase, XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase, XDH)基因XYL1和XYL2来实现的4。虽然代谢工程菌株有较高的木糖利用率，但在发酵过程中，中间产物木糖醇积累4，代谢流不能很好地向下进行，已成为酿酒酵母木糖代谢工程菌生产乙醇的瓶颈问题。其主要原因是XR和XDH的辅酶分别倾向于NADPH和NAD+（图1），一方面这两个辅酶在酿酒酵母中不能直接转化，其再生过程彼此独立， 造成了细胞内辅酶氧化还原的不平衡，另一方面，在乙醇发酵的氧限制条件下，酵母细胞内NADH积累，不能及时还原成XDH所需的辅酶NAD+，使得中间产物木糖醇积累，影响乙醇得率的提高。利用辅酶工程手段，改变细胞内辅酶的比率，实现辅酶的再生，是解决这一问题的有效措施之一。1辅酶在酵母中的作用及转化形式烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是代谢中的重要辅酶，酿酒酵母中由于缺乏转氢酶，二者的代谢是不相偶联的，作用也不同，NADH主要用于分解代谢，而NADPH则主要参与合成代谢。图1真菌木糖代谢流程图Fig.1Xylose metabolic pathway in fungi在酿酒酵母中，糖分解及代谢产物生产过程产生大量NADH。为了维持细胞正常生长和代谢流顺利进行，NADH氧化还原必须保持平衡。在好氧生长条件下，酵母中NADH的氧化可以通过线粒体膜上的电子传递链实现；而在氧缺乏条件下，NADH不能通过线粒体电子传递链被氧化，NAD+再生受阻，细胞需通过糖酵解过程中的产物如磷酸二羟丙酮作为内源电子受体再生细胞质中的NAD+，从而造成甘油等代谢产物的积累。在引入XR、XDH途径的重组酿酒酵母工程菌，在限氧条件下NADH积累导致木糖醇的大量产生。NADPH是还原力的主要来源，在酿酒酵母中，NADPH产生主要来源于磷酸戊糖途径，而消耗主要用于合成代谢，包括脂类的合成，氨基酸、核酸的合成等。2辅酶工程在重组酿酒酵母木糖代谢途径中的应用为了有效生产酒精，并减少木糖醇等副产物积累，酿酒酵母木糖代谢工程的一个重要方面就是解决辅酶的氧化还原平衡问题。目前，已有利用辅酶工程在大肠杆菌（Escherichia coli）57和乳酸菌（Lactococcus lactis）8细胞内改造NADH氧化还原状态的成功报道。对于酿酒酵母辅酶代谢的改造，国外也已有相关尝试和研究，有的已经取得了比较良好的效果，主要集中在以下几个方面。2.1引入转氢酶2.1.1引入外源转氢酶转氢酶（Transhydrogenase）是一种直接催化两种辅酶之间可逆转换的酶9（图2）。它有两种存在形式，一种是膜定位嘧啶核苷酸转氢酶，通常催化图2中的反应方向，同时消耗ATP。另一种是可溶性转氢酶，存在于细胞质中，通常催化图2中的反应，不需要能量参与。酿酒酵母本身不含有转氢酶，因此氢离子不能在NADPH和NADH间直接转移。Anderlund等10将来源于E. coli的膜定位转氢酶基因（PntA，PntB）转入酿酒酵母，得到了很高的转氢酶活性，但是该酶没有在线粒体中表达，而定位在了内质网上，并且反应中氢离子转移方向与在E. coli不同，是从NADPH转移到NAD+，即图2中的方向。Nissen等11将来源于Azotobacter vinelandii的可溶性转氢酶转入酿酒酵母，由于缺乏NADPH导致酮戊二酸的大量形成，反应方向也是利用NADPH和NAD+产生NADH和NADP+（图2中的方向）。然而在重组酿酒酵母木糖代谢过程中，由于XR和XDH的作用，导致细胞质中NADH和NADP+积累，需再生NAD+和NADPH，才能保证代谢顺利进行。引入外源转氢酶后，辅酶产生方向与所需方向相反，因此目前实验结果尚不能起到提高重组酿酒酵母利用木糖生产酒精的能力。NADH+NADP+xHp+NAD+NADPH+xHn+图2转氢酶催化的NAD(H) 和 NADP(H)之间的可逆转化Fig.2The reversible transfer between NAD(H) and NADP(H) catalyzed by transhydrogenase 2.1.2通过超表达内源酶基因获得的系统转氢酶效果Santosa等12构建了2个超表达苹果酸酶（Malic enzyme, MAE1）的重组酿酒酵母菌株。其中一个菌株超表达野生型的线粒体苹果酸酶及丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase, PYC1），另一个菌株表达缺少线粒体定位信号的苹果酸酶及丙酮酸羧化酶（图3）。由于苹果酸酶催化NADPH生成，丙酮酸羧化酶促使NADH消耗，使2个重组酿酒酵母菌株分别在细胞质和线粒体中获得了系统转氢酶效果，且方向为图2中的方向。从这一研究结果分析，如果此改造用于酿酒酵母木糖代谢工程研究，是解决XR、XDH氧化还原不平衡可能的有效方法之一，但相关研究目前尚未见报道。2.2增加代谢中可利用的NADPH及实现NADH厌氧条件下的氧化通过增加或阻断某一代谢途径，减少NADPH的旁路消耗，增加木糖代谢中可利用的NADPH，或者将木糖代谢过程中产生的NADH，实现在厌氧条件下的氧化也是解决辅酶氧化还原平衡问题的有效方法。图3超表达苹果酸酶的重组酿酒酵母代谢图Fig.3The biochemical reactions in the recombinant S. cerevisiae overexpression malic enzyme and pyruvate carboxylase(a):The control strain or a strain with overexpression of malic enzyme and pyruvate carboxylase; (b):The strain where malic enzyme is overexpressed lacking the mitochondrial targeting sequence, but where the wildtype gene is still present with its native promoter在酿酒酵母中，铵吸收主要由NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶参与，它催化铵和酮戊二酸形成谷氨酸，消耗大量NADPH。为减少酿酒酵母木糖代谢工程菌NADPH旁路消耗及增加NADH氧化，提高木糖的利用，Roca等13在表达P. stipitis XR、XDH及内源XK的重组酿酒酵母中敲除了铵吸收的主要酶基因NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶基因（GDH1），并通过超表达NADH依赖型谷氨酸脱氢酶基因（GDH2），或超表达GSGOGAT途径谷氨酸合成酶基因（GLT1）和谷铵酰铵合成酶基因（GLN1），使酵母能完成铵吸收过程。结果显示，在超表达GDH2后，酿酒酵母工程菌在厌氧分批发酵中，与出发菌株相比酒精产量增加了8，木糖醇的积累减少了44。而超表达GSGOGAT途径的GLT1和GLN1在碳源限量的厌氧连续发酵中，酒精的产量提高了16。葡萄糖6磷酸脱氢酶催化的反应是NADPH 产生的主要途径之一，但它同时还催化产生二氧化碳，造成了碳源的浪费。Verho等14在表达P. stipitis XR、XDH及内源XK的重组酿酒酵母中敲除了葡萄糖6磷酸脱氢酶基因（ZWF1），为便于NADPH再生，同时表达了来源于Kluyveromyces lactis的NADP+依赖型3磷酸甘油醛脱氢酶基因（GDP1），使NADPH通过NADPGADPH途径再生，而不与二氧化碳产生途径相偶联（图4）。改造后，细胞内源与外源2种甘油醛脱氢酶同时发挥作用，一方面可以再生细胞中NADPH，另一方面也可以减少NADH的还原。厌氧分批发酵结果显示，重组菌株与出发菌株相比，木糖醇减少了49，利用木糖生产的酒精增加了50。由于重组酿酒酵母利用木糖过程形成大量NADH，其氧化过程需要氧气，这与酿酒酵母酒精发酵的厌氧条件相矛盾，使得NAD+产生受阻，导致木糖醇积累。Sonderegger等15在表达P. stipitis XR、XDH及内源XK的重组酿酒酵母中利用重组磷酸转酮酶途径改变碳流向使NADH再氧化（图5），他们将来源于Bacillus subtilis的磷酸转乙酰酶基因（PTA）、来源于Entamoeba histolytica的乙醛脱氢酶基因（EhADH2）以及来源于Bifidobacterium lactis 5磷酸木酮糖/6磷酸果糖磷酸转酮酶基因（XFP），转化入表达P. stipitis XR、XDH及内源XK的酿酒酵母重组菌株，建立木糖发酵的磷酸转酮酶途径，NADH在此途径中可以再氧化。厌氧分批发酵结果显示，木糖醇形成减少31，乙醇产量增加了25。但超表达磷酸转酮酶增加了乙酸的积累，因此他们敲除NADP+依赖型乙酸脱氢酶基因（ALD6），减少乙酸的形成，与表达P. stipitis XR、XDH及内源XK的重组菌株相比，此重组菌株乙醇增加了20，木糖发酵率增加了40。图4表达K. lactis来源的GDP1重组酿酒酵母木糖代谢图Fig. 4The xylose metabolic pathway in the recombinant S. cerevisiae which were expressed K. lactis GDP1:Expression the K. lactis NADPGAPDH encoded by GDP1:The deletion of ZWF1 gene, coded G6P dehydrogenase which caused wasteful CO2 production上述实验表明，通过引入辅酶相关代谢途径，可以较为有效地增加细胞中可利用的NADPH，并实现NADH的氧化，使得木糖醇积累显著下降，酒精产率有所提高，因此辅酶相关代谢途径的有效改造，对于提高重组酿酒酵母木糖代谢具有较大的发展潜力。3改变XR、XDH的辅酶偏好通过改变P. stipitis的XR、XDH的辅酶偏好，使二者利用的辅酶能够相互偶联，是解决酿酒酵母木糖代谢工程菌辅酶不平衡问题的又一探索性研究。Watanabe等16分析多羟基脱氢酶对NAD+和NADP+结合区域的氨基酸序列特点，利用点突变改造P.stipitis XDH对NADP+的特异性结合能力，经三点突变及四点突变后得到了辅酶特异性完全改变的木糖醇脱氢酶。其对特异性结合NADP+的Kcat/Km比改造前提高了4500倍。Metzger等17分析了Thermoanaerobium brockii的乙醇脱氢酶中NADP的识别序列，将其引入P.stipitis的XDH中，改造后突变的酶在酿酒酵母中可以同时利用NAD+和NADP+，且两者的表观Km相同，表明该酶对于NADP+的结合能力有所提高。上述研究表明，通过酶分子的结构改变，改变酶对辅酶的结合能力，来解决辅酶氧化还原不平衡问题，也有了较大的进展。4总结与展望以上研究结果表明，利用辅酶工程改良木糖利用重组酿酒酵母菌，解决辅酶氧化还原平衡问题，已开展多方面的研究和尝试，其中，利用辅酶工程手段，引入辅酶相关代谢途径，增加细胞中可利用NADPH，实现NADH再氧化，也已获得了较好的效果；外源转氢酶的引入，虽然可以直接实现两种辅酶间的可逆转换，但目前实验表明，在酿酒酵母中，转氢酶催化产生的辅酶与木糖代谢的所需辅酶不同，还不能解决XR、XDH氧化还原不平衡问题；而超表达内源苹果酸酶使酵母获得系统转氢酶效果的改造，若用于酿酒酵母木糖代谢工程研究，应是解决此问题的可能有效方法之一。另外，通过改变XDH辅酶偏好，使它对NADP+的结合能力大幅度提高，XR、XDH所需辅酶能相偶联，应是一个解决此问题的方法之一；此外，NAD(H)激酶也可催化两种辅酶间的转换，对它的研究有望对该问题的解决作出新的尝试。总之，利用辅酶工程改造细胞内辅酶的比率，实现辅酶的再生，可使酿酒酵母木糖代谢工程菌向着有利于木糖利用、乙醇产生的方向进行，为最终实现利用木质纤维原料工业化生产乙醇奠定了坚实的理论基础。图5重组酿酒酵母中的重组磷酸转酮酶途径15Fig.5The recombinant phosphoketose pathway in S. cerevisiae:The recombinant phosphoketose pathway;PK: phosphoketolase; PTA: phosphotransacetylase; ACDH: acetaldehyde dehydrogenase; ACD1: acetylCoA hydrolase; ALDx: aldehyde dehydrogenase isoenzymes参考文献1 张翀, 邢新会. 辅酶再生体系的研究进展.生物工程学报, 2004, 20(6):811816Zhang C, Xing X H. 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Saccharomyces cerevisiae has been traditionally used in producing ethanol from