柱色谱是较经典的有机物分离技术.doc

柱色谱是较经典的有机物分离技术，原理和薄层色谱相同，但装置有所不同，主要由一个均匀玻璃柱和填充填料组成，填料是决定柱效的主要因素，填料必须满足具有不溶于所使用流动相、不使欲分离的样品破坏或分解、惰性大、可逆性强和吸附容量大。同时，填料颗粒直径要均匀。最常见的柱色谱是硅胶色谱、氧化铝色谱、离子交换柱色谱、聚酰胺柱色谱和凝胶柱色谱。 分配柱色谱是利用混合物中各组分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同，而得到分离的方法，分为正相和反相分配色谱两种类型：正相分配色谱：以水或亲水性溶剂为固定（液）相，以水不相混溶的有机溶剂作移动相的分配色谱称为正相分配色谱。一般而言，分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物，常用正相分配色谱。反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定（液）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为反相分配色谱。当分离脂溶性或极性较小的成分，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反相分配色谱。实践中有70%以上的分配色谱都采用反相色谱。分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸、酚类及氨基酸的衍生物；对某些非极性化合物，如油脂、甾体等物质，可采用反相分配柱色谱法。应用实例：狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离支持剂：国产层析硅胶80100目，加2/3量的水（以乙酸乙酯饱和），调匀，再以乙酸乙酯（水饱和）浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度比 1:2 以上。实验方法：取样品与1 2倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙酯（含0.5%甲醇）洗脱，分部收集，各流分均作纸色谱及薄层色谱检查，比移值相同的流分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得到洋地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷三种单体。 吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有吸附剂的柱子中，再加适当的溶剂（洗脱剂）冲洗，由于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。柱色谱装置如图示。 混合物中含A、B两个组分，溶解后加至色谱柱中。开始A和B都被吸附在柱的上端，形成原始谱带。当加入洗脱剂冲洗时，A和B将随着向下流动而从吸附剂上洗脱，接着又遇到吸附剂又被吸附，又随着向下流动的洗脱剂冲洗而被洗脱，如此连续不断地被再吸附、再洗脱，经过一段时间的冲洗后，由于A、B的极性不同，在该吸附剂和洗脱剂上被吸附和被洗脱的性能也不同，最终出现A、B两个色谱带。由于A的吸附力小于B，故A 移行较快，在色谱柱下段，而B移行较慢，在柱的上段。继续用溶剂冲洗，A、B将先后被洗脱出来。分别定量收集洗脱液，用TLC跟踪检验，斑点相同的流分A、B两个纯品化合物。1、硅胶柱色谱 层析硅胶为一多孔物质，可用通式SiO2.xH2O表示，它具有多孔性硅氧烷交联结构，由于其骨架表面具有很多游离和键合活性状态硅醇基团，硅胶能通过氢键与极性或不饱和分子相互作用。硅胶的吸附能力与硅羟基数量有关。另外，硅胶随着含水量的增加活性降低，若硅胶游离水高达17，其吸附能力极低。 色谱用硅胶应该是中性无色颗粒，但是由于制造过程常接触强酸，故在实验前一般要检查酸性，不低于pH=5才可使用，而且使用前一般经120C烘24h活化。 硅胶柱色谱适用范围广，能适用于非极性混合物，也能用于极性混合物，如芳香烃、萜类、甾体、生物碱、蒽醌、酚类、磷脂类、脂肪酸和氨基酸等有机物分离。2、氧化铝柱色谱 氧化铝柱色谱是另一种最常用色谱方法。氧化铝是由Al(OH)3直接在高温下（约600C）脱水制得，主要形成g-Al2O3。现在用于柱色谱的氧化铝商品分为中性、碱性和酸性三种。中性氧化铝适用于分离醛酮、萜类以及对酸碱不稳定的酯和内酯有机物；酸性氧化铝适用于有机酸、酸性氨基酸和酚类物质的分离，而碱性氧化铝对于分离植物中碱性成分如生物碱颇为理想，也适用于萜类、甾体、强心苷等化合物的分离。 和硅胶一样，氧化铝的活性与含水量关系极大，在一定温度下除去水分，就可以使氧化铝活化，加入一定量水即可使活性改变。氧化铝的活化比硅胶所需的温度要高得多，因而需要在高温炉中进行，常规的烘箱不能完成对氧化铝的活化。硅胶和氧化铝均为极性吸附剂，有以下特性：、对极性物质具有较强的亲和能力。同为溶质，极性强者优先被吸附。、溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力随之减弱。、 溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂，又被后者置换洗脱下来。3、活性炭柱色谱 其吸附作用与硅胶和氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和力，水溶液中吸附最强，有机溶剂中较弱。一定条件下，对芳香化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子量化合物的吸附力大于小分子量化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。 4、聚酰胺柱色谱聚酰胺是通过酰氨基聚合而成的一类高分子化合物，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键结合而被吸附，而使这些有机物与不能形成氢键的化合物分离。聚酰胺柱色谱法主要用于酚类黄酮体、蒽醌等有机物的分离。三、离子交换柱色谱离子交换柱色谱是用离子交换树脂代替硅胶和氧化铝作为填料的一种柱色谱方法。离子交换树脂是一种多功能基高分子化合物。每个树脂颗粒都由交联的具有三维空间立体结构的网络骨架组成，在骨架上连接许多可以活动的功能基，这种功能基能离解出离子，可以与周围的外来离子相互交换，而且这种交换是可逆的。根据所交换离子性质的不同，离子交换树脂分为阳离子和阴离子交换树脂。每类树脂根据它的离解性能大小，又分为强、中、弱型。 离子交换柱色谱方法在工业上用途很广，可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等天然有机物的分离。四、凝胶柱色谱 凝胶柱色谱是利用凝胶微孔的分子筛作用对分子大小不同的物质进行分离的一种柱色谱法。当被分离有机物质的分子大小不同时，它们能够进入凝胶内部的能力出现差异。 各组分在凝胶柱色谱中被洗脱出柱的先后顺序基本上是按分子大小排列的，即按分子由大到小流出，从而得到分离。这种在凝胶柱色谱中分离多种成分时，组分按分子量递减的顺序先后从柱中流出的现象，称凝胶柱色谱的洗脱规律。影响柱色谱分离效果的主要因素及柱色谱的操作技术一、影响柱色谱分离效果的主要因素固定相的选择洗脱剂的选择在柱色谱中，用于冲洗加有样品柱子的溶剂（单一溶剂或混合溶剂），习惯上称洗脱剂。洗脱剂的选择，对组分分离关系极大。溶剂的洗脱能力，主要取决于溶剂的极性，可根据溶剂的介电常数作大致判断。在柱色谱中，洗脱剂的洗脱能力还与被分离物质的极性和所选用的固定相性质有密切关系。溶剂的介电常数大小顺序是：水 甲醇 乙醇 丙酮 乙酸乙酯 乙醚 三氯甲烷 二氯甲烷 苯 四氯化碳 环己烷 正庚烷 正己烷（石油醚）。 为了寻找合适的洗脱剂，应先作薄层或纸色谱试验，找到合适的溶剂系统后再应用到柱色谱中去。如单一溶剂洗脱效果不好，可用混合溶剂，对成分复杂的混合物可用梯度洗脱。 洗脱溶剂的选择应结合被分离物质与固定相的性质来考虑. 被分离物质的性质被分离物质与固定相、洗脱剂共同构成柱色谱中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的固定相与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况直接与被分离物质的结构与性质有关。首先要考虑被分离物质的极性。常见官能团极性强弱顺序是：R-COOH Ar-OH H-OH R-OH R-NH2 R-SH R-CHO R-CO-R R-COOR R-N(CH3)2 R-NO2 ROCH3 -CH=CH- -CH2-CH2- 。有机化合物极性强弱的大致判断：例如葡萄糖，因分子中含有许多-OH，故为极性化合物。又如氨基酸，因分子结构中既有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸，如硬脂酸C17H35COOH，虽也含有羟基这样的强极性官能团，但分子的主体由长链烃基所组成，故极性依然很弱。在选择柱色谱分离条件时，要根据被分离物质的性质、固定相及洗脱剂的性质这三者的相互关系来考虑。欲分离中等极性的物质，需选用中等极性的洗脱剂和中等活性的吸附剂。同理，欲分离极性较强的物质，需选用极性较强的洗脱剂和极性较弱的吸附剂。如被分离物质的极性较小，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。二、柱色谱的操作技术任何柱色谱操作都存在装柱、上样和洗脱三个步骤：、装柱好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。主要问题是要保证固定相在柱中均匀紧凑，不能有气泡或裂痕出现。一般柱子的直径与长度比为1:1050。硅胶量是样品量的3040倍，具体的选择要具体分析。、关闭层析柱出水口，装入1/3柱高的缓冲液，将吸附剂缓慢地倒入柱中。、打开出水口，控制适当流速，使吸附剂均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有23cm高的缓冲液，同时关闭出水口。上样过程一般要迅速，样品最好用洗脱剂相同的溶剂溶解，而且必须将上样时可能粘附在柱上层的样品洗到固定相中才能再加洗脱剂进行淋洗。 加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。 上样的方法有干法和湿法两种。湿法一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，溶剂越少越好。干法上柱中硅胶量根据样品而定，应保证在旋干后，看不到明显的样品存在。最好在柱中不超过23cm，以确保分离效率。洗脱的过程关键是选择合适的洗脱溶剂，洗脱剂的选择一般先用薄层板试验多次后确定。 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。 分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。洗脱的过程关键是选择合适的洗脱溶剂，洗脱剂的选择一般先用薄层板试验多次后确定。 洗脱的过程关键是选择合适的洗脱溶剂，洗脱剂的选择一般先用薄层板试验多次后确定。 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合