酵母菌的分离提取.doc

山东轻工业学院2010届本科生毕业论文摘 要从烟台葡萄果皮以及干红葡萄酒酿造过程不同阶段发酵液中取样分离得到117株酵母菌株，将分离菌株用WL培养基进行鉴别培养，依据菌落色泽初步归类，然后利用26S rDNA D1/D2区域序列分析，并结合其形态学和生理生化特性对21菌株进行分类鉴定,确定了发酵过程中酵母种类及其菌群变化特点。用杜氏管发酵试验对117株酵母菌株筛选，挑选其中21株发酵力、香味较好的酵母菌株完成抗性和发酵特性评价。有5株发酵力强的菌株进行了模拟酒精发酵试验，结果SL8-1发酵产酒精度最高为10.8，SL9-1发酵产酒精度为10.2高于RC212的产酒度9.2，SS9-2产酒精度与商品酵母RC212相同，SS5-1的产酒精度为7.4， SS1-5酵母菌株发酵产酒精度为0，但香气浓郁。对筛选的5株优良菌株进行26SrDNA D1/D2区分子鉴定，并与模式菌株序列比对分析确认5株酵母SL8-1,SL9-1,SS9-2,SS1-5,SS5-1均为酿酒酵母，此后以商品酵母为对照进行同步RAPD扩增，比较遗传多样性，结果显示这5株酿酒酵母菌株与发酵时接入的商品种子酵母之间多态条带无明显差异。但两个菌株（SL8-1,SL9-1）的发酵特性，尤其产酒率显著高于商品酵母。 关键词:干红葡萄酒 酵母 发酵特性 评价 鉴定ABSTRACT117 natural yeast strains were isolated from Yantai grape fermentation solution of different phase In this paper. Then the strains were classified according to colorful reaction characteristics that showed on the WL medium, and were identified based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequence analysis and physiological morphologic characterization, in order to study the changes of the yeasts during the period of fermenting.21 strains with high fermentation capacity and strong aroma were selected out from 117 strains by Durham tube method. Among them ,5 excellent strains have good fermentation capacity and nice smell. The result of alcohol fermentation showed that alcoholicity of SL8-1 yeast strains was10.8, alcoholicity of SL9-1 yeast strains was10.2, SS9-2 has same alcoholicity with RC212, alcoholicity of SS5-1 yeast strains was7.4, alcoholicity of SS1-5yeast strains was zero ,but it had thick aroma. DNA from the excellent yeast strains then were extracted by micro glass beads and amplified by PCR method. Compare the result sequence with the model strain so as to classify the yeast strains, the result showed that all the 5 strains are saccharomyces. DNA from the excellent yeast strains were analyzed by RAPD-PCR method in order to determine their homology with commercial yeast RC212. We have got that the 5 strains have no difference with the commercial yeast RC212,but the alcoholicity of SL8-1,SL9-1 is better than the commercial yeast.Key Words: Red wine;Yeasts; Fermentative characteristic; Assessment; Identification第一章 前言1.1.干红葡萄酒简介葡萄酒是由以整粒或压碎的新鲜葡萄浆果或葡萄汁经酵母发酵而成的低度饮料酒，其成分构成极其复杂，酒中主要成分源自葡萄果粒，如糖分、酒石酸、苹果酸、花色素、单宁、矿物质等，也有部分组分来自发酵过程和陈酿期间，如乙醇、甘油、酯类等。葡萄酒不仅具有人体生长发育所需要的营养物质，而且还含有一些调节人体生理机能的微量物质。葡萄酒中的白藜芦醇可阻止血小板凝聚，预防血栓病，抑制蛋白质-酪氨酸激酶的活性，有防癌抗癌作用。另外，葡萄酒可以预防肾结石，助消化等1。在实际生产中，葡萄酒酿造从来不是纯粹发酵，这不仅是因为从开头到底没有完全由一种酵母发酵，而且往往会发现乳酸菌发酵葡萄醪液中的苹果酸，这种发酵是常常受到欢迎的。31.1.1干红葡萄酒的工艺流程红葡萄分选 破碎 去梗二氧化硫 葡萄浆 酵母 发酵 压榨 皮渣前发酵酒调成成分 后发酵添桶 第一次换桶新干红葡萄酒 陈酿 酒脚蒸馏 均衡调配澄清处理 包装杀菌干红葡萄酒 白兰地原料1.2酵母菌特性酵母菌是重要的工业微生物与科学研究的模式生物，在食品、医药、能源化工、科学研究和环境治理等领域有重要应用价值。野生酵母资源的开发利用是发酵工业菌种改良的基石，也是基因多样性的重要来源2 。酵母菌的增殖力即能在短时间内繁殖出大量活细胞的酵母菌，才能称为优质酵母菌。影响酵母菌繁殖速度的因素，首先是营养物质、氧气，其次是温度(温度对酵母菌能量和基础物质代谢产生影响)，另外是接种酵母菌的活力(取决于有关酵母菌的营养状态和生长时间，应在对数生长期内进行转接)。 6酵母菌的耐酸、耐酒精能力：每种酵母菌的抗酸、抗酒精和耐高温的能力是有差异的。酸度和酒精度对酵母菌的生长和发酵有阻碍作用，高温导致酶系统的钝化以至失活。当酒精度10(vo1)时酵母菌生长被抑制。高浓度发酵时，渗透压高，易引起酵母菌新陈代谢紊乱，酵母菌活力下降。61.2.1酵母菌对干红葡萄酒发酵过程的影响葡萄汁的发酵是多个酵母菌种及菌株互作生长和发展变化的复杂体系。葡萄酒发酵过程是一个复杂的生态和生化过程，包含不同酵母属种此消彼长的变化。多种酵母在发酵过程中的相互协作，可以有效地增加葡萄酒风味的多样性7，但也可能影响葡萄酒质量的稳定性8 这些酵母菌的来源有：葡萄浆果表面的土著菌群，酿酒设备和酒厂环境中的土著菌群，接种的人工酵母等，5本文主要研究从葡萄汁发酵液中分离到的酵母菌株，葡萄酒酵母菌在干红葡萄酒的发酵过程中起到很重要的作用，葡萄酒酵母在果汁中产生葡萄香或葡萄酒香，酵母对葡萄酒的香味起到极其重要的作用。8不同种的酵母菌所能发酵糖的种类不同，因此，需视原料品种所提供发酵糖的类型来选择适当的酵母菌。作为酿酒酵母菌，能够发酵霉菌淀粉酶的分解产物(如葡萄糖和麦芽糖等)，也可使半乳糖、蔗糖及13的棉子糖发酵，但不发酵乳糖。多数酵母菌有蔗糖酶，可使蔗糖发酵，但发酵强弱有所不同。12酵母菌的发酵力指酵母菌发酵糖产生酒精能力的大小。只有酒精转化率高，残糖率小，才能称为发酵力强的酵母菌。91.2.2酵母菌的研究现状近年来，国内外对葡萄酒酵母菌的研究热点主要集中在特色天然葡萄酒酵母菌的分离和筛选以及葡萄酒酵母菌的多样性与葡萄酒特殊风味间关系的研究。酵母菌在自然界中广泛存在， 我们可以从不同的生物环境中分离得到，根据不同的地区、不同的环境可筛选出具有地域特色或者品种特色的优良酵母菌株。即选用从地产葡萄上分离、筛选出的优良天然酵母进行发酵，必须经过多种菌株的发酵比较，根据其发酵能力和发酵结果筛选出适合某种葡萄酒生产的天然优质酵母，用于产生色香味俱全的优质名酒。除此之外，酿酒酵母菌对作为地区特色品种的葡萄的特色风味和总体风味的影响方面的研究，逐渐显露出较大的发展趋势。5在酵母的资源利用方面，法国、美国和意大利葡萄酒发达国家走在世界前列，适用于不同产地、葡萄酒类型和葡萄品种的“特种”酵母已经逐渐取代了“广适性”酵母。目前我国在葡萄酒酵母的研究和利用方面还处于起步阶段，葡萄酒生产所用菌种大部分依赖进口，单一菌种接种的纯种发酵使得葡萄酒失去了其特征的香气和风味。但从酿造学的观点来看，用本土的土著菌种接种发酵或者与其他接种物相混合进行发酵，可以生产出具有地区特色的葡萄酒另外，当地优选的菌种由于适宜当地的风土环境，因而具有更强的发酵竞争力。121.3目的意义来自葡萄果皮的天然酵母在葡萄酒生产过程中对商品酒的质量和风味有重要影响。通过分离、鉴定和发酵特性的评价，了解商品酵母与天然酵母在酒精发酵过程中的变化规律，探究天然酵母菌株对干红葡萄酒色、香、味及营养成分的影响，以及与商品酵母菌株之间的协同效应，通过发酵试验筛选出发酵特性以及香味比较好的菌株进行酒精发酵试验。1.4研究内容和技术路线 采集葡萄果皮酵母菌株采集不同时期发酵液 分离和纯化酵母菌株 细胞形态鉴定 菌落形态观察 菌种分子鉴定 酵母菌株抗性评价 优良菌株发酵特性评价第二章 材料和方法2.1.材料2.1.1菌株分离自烟台葡萄果皮及干红葡萄酒发酵过程中不用时期的发酵液，共分离得到酵母菌株117株。2.1.2主要培养基YEPD固体培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸粉1%，琼脂2%WL固体培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.055%，氯化钾0.0425%，氯化钙0.0125%，氯化铁0.00025%，硫酸镁0.0125%，硫酸锰0.00025%，溴甲酚绿0.0022%，pH值为6.5。抗性及发酵特性评价培养基 耐高糖液体培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，不同浓度的葡萄糖（400.0g/L、500.0g/L、600.0g/L ）蒸馏水1L，115灭菌30min。耐SO2培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，蒸馏水1L，121灭菌20min后添加H2SO3，SO2终浓度至200、300、400、500、600mg/L。耐高温培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，蒸馏水1L，121灭菌20min后处理温度分别为35、40、45、50、55。耐酒精培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，蒸馏水1L，121灭菌20min后，添加无水乙醇，终浓度至60、80、120、140、160mL/L。耐高渗培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，蒸馏水1L，添加固体NaCl使其终浓度至60.0g/L、80.0g/L，100.0g/L，120.0g/L，140.0g/L，160.0g/L， 121灭菌20min。耐酸碱培养基：葡萄糖 20g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，蒸馏水1L，处理pH分别调至1.5、2.0、2.5、11.0、12.0、13.5，121灭菌20min。酒精发酵模拟培养基：酵母浸粉10g，蛋白胨10g，葡萄糖200g，蒸馏水1L，115灭菌30min。2.2 主要试剂(1) 基因组DNA提取：破菌缓冲液：2%（V/V）Triton-100；1%（W/V）SDS；10mmol/L TrisHCl，pH8.0；1mmol/L EDTA。酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）；乙酸铵（4mol/L）1mg/mLRNA酶；灭菌超纯水；无水乙醇（分析纯）；浓硝酸；玻璃珠(2) 琼脂糖凝胶电泳：1%琼脂糖凝胶；DNA Marker；电泳上样缓冲液；EB染液； TE 电泳缓冲液。(3) PCR扩增：双蒸水；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶、溴化乙锭 ；26S rDNA的D1/D2区引物(NL1)：5-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3；26S rDNA的D1/D2区引物(NL4)：5-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3。2.3 主要仪器设备BCM-1000A型单人超净工作台苏州安泰技术有限公司E200光学显微镜日本Nikon公司立式自动高压灭菌锅上海申安医疗仪器厂DYY-12型电泳仪北京六一仪器厂TC-XP PCR扩增仪杭州博日公司SX-300凝胶成像系统上海四星生物公司DK-S24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司H2-9310K型摇床上海精宏实验设备有限公司611VF-超纯水仪德国Sartorius公司SIM-F140制冰机美国西蒙公司2.4实验方法2.4.1酵母菌株的分离从烟台地区收集到蛇龙珠和赤霞珠两个葡萄品种，并对发酵罐中的不同时期的发酵液进行取样，采用梯度稀释法将其涂布在YEPD固体培养基上，28培养，然后挑取单菌落进行多次划线纯化，将纯化的菌株斜面保藏备用。2.4.2 WL培养基初步分类 WL培养基常用于监测葡萄酒发酵过程中的酵母菌群，最近，Cavazza等的研究表明，葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型的酵母菌都可以基于其在WL培养基上生长所形成的菌落颜色及形态进行归类和区别，而且描述了主要的葡萄酒相关酵母菌在WL培养基上的培养表现。将分离得到的菌株划线接种于WL培养基上，28培养5-7d后，观察记录菌落的颜色和形态特征，依此进行初步分类。2.4.3 酵母菌株的分子生物学鉴定 酵母菌株基因组的提取(玻璃珠法)（1）将供试菌株接入盛有20 mL YPD液体培养基的三角瓶中，28，200 r/min摇床培养16-18h。（2） 取1.5 mL菌株培养物，室温下在离心机上3000r/min离心5min，去掉上清。（3）细胞用0.5mL无菌水重悬，室温下3000r/min离心30s，倒掉上清，滤纸吸干液体，在漩涡振荡器上快速振荡分散菌体沉淀。（4）细胞用200l破菌缓冲液重悬，加0.3g玻璃珠（约200L 体积）及200L酚/氯仿/异戊醇，来回倒几下之后在涡旋振荡器上高速振荡3-5min。（5）加200LTE缓冲液，静置3 min。（6）快速振荡，12000r/min离心5min，室温下将水相转移到一个干净的离心管中，加2倍体积（400L）预冷无水乙醇，颠倒混匀出现絮状沉淀。置于20冰箱内冷藏备用（7）室温下12000r/min 离心5min，去上清，沉淀用200LTE缓冲液重悬。（8）加15LRNA酶A（1mg/mL），混合，37温育30 min。（9）加20L乙酸铵（4mol/L）及2倍体积预冷无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清，立刻加入的乙醇，洗涤，离心，干燥沉淀，（10）所得的DNA用50LTE缓冲液重悬,3000r/min离心30s,置于20冰箱内冷藏备用。电泳检测基因组DNA 取7L上样液（2L溴酚蓝、5L DNA溶液）在1%琼脂糖凝胶上电泳30min溴化乙锭（EB）染色20min，经凝胶成像系统检测所提DNA纯度及亮度。PCR扩增目的片段(1)PCR反应体系的组成（50L体系）(2)PCR反应条件与扩增操作步骤 正向引物 NL1 （5-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3）， 反向引物NL4（5-GGT CCG TGT TTC AAG ACG -3）。反应体系：10PCR Buffer 5L，Mgcl2 3L ,dNTPs(2.5M)5L,NL1(5M)5L,NL4(5M)5L,模板DNA 3L，Taq酶 0.5L，用ddH2O补足到50L； PCR扩增程序：95预变性5min；（94变性1min，53退火8min，72延伸1min20s）36个循环；72最后延伸10min。(3) PCR扩增产物的电泳检测 取5L PCR扩增液+2L溴酚蓝上样缓冲液混匀，于1%的琼脂糖凝胶上点样，以7L DNA Marker为对照，电泳,EB染色后经凝胶成像系统检测。剩余PCR反应产物原液20保存，备用。序列测定及系统发育分析对酵母菌株所测的26S rDNA D1/D2序列图谱校正后，提交GenBank，并在GenBankEMBLDDBJ等国际核酸序列数据库中进行同源序列搜索（BLAST search），以比较测试菌株与酵母菌种模式株对应序列的相似程度，并结合形态学及生理学特征分析对其做出鉴定。菌株间的序列应用Clustal-X进行多序列匹配比对，并用MEGA构建系统发育树展示菌株之间的亲缘关系。RAPD分析法RAPD是随机扩增多态性DNA的简称，RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物通过PCR反应扩增靶细胞DNA，扩增的产物通过电泳分析而获得凝胶电泳图谱，分析DNA片段数量和大小的多态性，从而比较受试菌株间基因的差异,RAPD分析法快速、简便、通用性好，对DNA的需要量少、质量要求低。缺点是该法尚未标准化，结果往往不明确，重复性较差。2.5供试菌株的抗性评价配YPD液体培养基，取8mL分装于口径为18mm的试管，放入倒置的杜氏发酵管，用棉塞封口后包扎，118灭菌20min，备用。用灭菌竹签挑取一定量的菌体接入灭过菌的培养基中置28培养箱中培养，在此期间观察杜氏管内气体集存与否及其积存量，每隔4h观察一次并记录产气情况，连续记录7d，发酵结束后嗅觉评价其气味情况并记录，初步筛选出产气好并有香味的菌株。对21株供试酵母菌株进行了耐酒精性、耐温性、耐渗性、耐高糖性、耐酸碱性和耐SO2六个指标的抗性测定。2.5.1耐渗实验配制含不同NaCl浓度的耐渗培养基，取8mL分装于口径为18mm的试管，放入倒置的杜氏发酵管，用棉塞封口后包扎、121灭菌20min，备用。用灭菌竹签挑取一定量菌体接入到灭过菌的培养基中置28培养箱中培养，在此期间观察杜氏管内气体集存与否及其积存量，每隔4h观察一次并记录产气情况，连续记录7d，发酵结束后记录其生长与发酵状况。2.5.2耐酒精实验配制YPD液体培养基，取8mL分装于口径为18mm的试管，放入倒置的杜氏发酵管，用棉塞封口后包扎，121灭菌20min，备用。接菌前把培养基放进超净台中紫外灭菌20min，然后用移液枪按不同的比例加入95乙醇，配制成不同浓度的耐酒精培养基。用灭菌竹签挑取一定量菌体接入上述培养基中置28培养箱中培养，同耐渗实验一样观察记录。2.5.3 耐温实验配制耐温培养基，取0.5mL分装于1.5mL离心管中，121灭菌20min，备用。用竹签挑取少量菌体接种到上述培养基中，分别置于35、40、45、50、55水浴锅中培养4h，然后取出点种到YEPD固体平板上，28培养箱中培养2-3d，观察平板上菌落生长与否，并记录。2.5.4耐酸碱实验配制YPD液体培养基，调成不同的pH（1.5、2.0、2.5、11.0、12.0、13.5）, 取0.5mL分装于1.5mL离心管中，121灭菌20min，备用。用竹签挑取少量菌体接种到上述培养基中，28培养箱中培养7d左右。然后取出点种到YEPD固体平板上，28培养箱中培养2-3d，观察平板上菌落生长与否，并记录。2.5.5耐SO2实验配制YPD液体培养基，取8mL分装于口径为18mm的试管，放入倒置的杜氏发酵管，用棉塞封口后包扎，121灭菌20min，备用。接菌前把上述试管放进超净台中紫外灭菌20min，然后用移液枪按不同的比例加入H2SO3原液，配制成不同浓度(200mg/L、300mg/L、400mg/L 、500mg/L、600mg/L)的耐SO2培养基。用灭菌竹签挑取一定量菌体接入上述培养基中置28培养箱中培养，与耐酒精实验一样观察记录。2.5.6 耐高糖实验配制不同浓度（400g/L、500g/L、600g/L）的高葡萄糖培养基，取8mL分装于口径为18mm的试管，放入倒置的杜氏发酵管，用棉塞封口后包扎，115灭菌30min，备用。用灭菌竹签挑取一定量菌体接入上述培养基中置28培养箱中培养，与耐渗实验一样观察记录。2.5.7 酒精发酵实验配制20%葡萄糖浓度的酒精发酵培养基，取100mL分别分装于6个250mL的三角瓶中，用纱布包扎封口，115灭菌30min，备用。取6支18mm口径试管，分别加入5mL YPD液体培养基，用棉塞封口后包扎，115灭菌30min，备用。选取5种发酵力好且产香的菌株，用灭菌竹签分别挑取相同量的菌体接入上述试管中置28培养箱中培养，制成活化的种子培养液。将活化的5株5mL种子酵母培养液,与对照液分别接种到上述三角瓶中，立即称重一次，28培养箱中静止培养，每间隔24h称重一次，连续称重至重量变化与对照的重量变化近乎一致时停止，测其总酸（以酒石酸计）、酒精度、残糖（以葡萄糖计）、挥发酸（以醋酸计），并闻其香味，以无菌发酵液为对照。 酒精度的测定以酒精计法测酒精度，先取样品50mL，加50mL蒸馏水，采用直接蒸馏法除去样品中的不挥发性物质，将收集的50mL蒸馏液倒入量筒内静置几分钟后放入温度计及酒精计，平衡后读数，同时记录测量时的温度，并查温度校正表进行温度校正，求得20时的酒精度。 总酸的测定总酸是发酵液中所有可滴定酸，是挥发酸和固定酸的总和。利用酸碱中和反应，以酚酞为指示剂，用碱标准溶液滴定，根据碱用量计算以主体酸表示的总酸含量。首先配制NaOH溶液，用烘至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾配制成溶液，对氢氧化钠溶液进行标定(滴定至呈粉红色，30s不退色，同时做空白试验)，计算出氢氧化钠标准溶液的浓度c(mol/L)，然后再分别取样品1mL(V1/mL)，稀释100倍后用上述标定好的氢氧化钠进行滴定，记录消耗标准氢氧化钠的体积(V/mL)，实验平行测定三次，取平均值。同时用蒸馏水代替样品做空白对照，记录消耗氢氧化钠标准液体积(V0/mL)，根据下面公式计算总酸：总酸(以酒石酸计，g/L)=(V-V0)cf1000/V1 其中f=0.075（为消耗1mL1 mol/L的NaOH标准溶液相当于酒石酸的克数）。 挥发酸的测定用蒸馏法蒸馏出挥发酸，以酸碱中和法测定其含量，将蒸馏出的流出液放入三角瓶中，用标准氢氧化钠溶液滴定，平行测定三次取均值，根据公式计算挥发酸含量：挥发酸(以乙酸计，g/L)=(V1c0.06001000)/V 其中c为NaOH标准溶液的浓度（mol/L）；V1为消耗NaOH标准溶液体积(mL)；0.0600为消耗1mL 1mol/L的NaOH标准溶液相当于乙酸的质量；V为取的样品体积（mL）。 残糖的测定用斐林试剂法测定残糖，首先配制斐林甲液、乙液 和0.25%葡萄糖标准溶液，进行预备试验和正式实验，先计算F(斐林甲液、乙液各5mL相当于葡萄糖的克数)再进行发酵液中残糖的测定。预备试验：斐林甲液、乙液各5于250ml三角瓶中，加入50ml水，摇匀，在电炉上较热至沸腾，在沸腾的状态下，有葡萄糖标液滴定，当溶液的蓝色消失至出现红色时，加入2d次甲基蓝指示液，继续滴定至蓝色消失，记录葡萄糖的体积。正式试验：斐林甲液、乙液各5ml于250三角瓶中，加入50的水，和比预备试验少1mL的葡萄糖标液，加热至沸腾，保持两分钟，加入2d次甲基蓝指示液在沸腾的状态下，于1分钟内用葡萄糖滴定至终点。根据下面公式计算残糖：X1=(F-cv)V21000)/(V1V3) 其中X1为残糖的含量（以葡萄糖计，g/L）；F为斐林甲液、乙液各5mL相当于葡萄糖的克数（g）；V1为吸取样品体积(mL)；V2为样品稀释后或水解后定容的体积（mL）；V3为消耗试样的体积(mL)。c为葡萄糖标液的浓度g/ml 第三章 结果与分析从葡萄果皮与葡萄汁发酵液中分离到的117株酵母菌中性状较好的菌株发酵特性酵母菌株通过平板进行初步归类，之后对菌株进行发酵特性评价与分子生物学鉴定。3.1酵母菌株的形态学特征从葡萄汁发酵液中筛选出的酵母菌株分别在YEPD固体与液体培养基中培养，记录其生长情况，各菌株形态学特征如表3-1所示。表3-1酵母菌株形态学特征菌株编号固体菌落形态液体培养形态SL8-1凸起，光滑，有光泽，反光，不透明，边缘整齐，乳白澄清,沉淀SL5-1凸起，光滑，有光泽，反光，不透明，边缘整齐，乳白澄清,沉淀SL4-1中间凸起，粗糙，褶皱状，暗淡，不反光，边缘不整齐，毛绒状，白色不透明澄清,沉淀SL5-2中间凸起，光滑有光泽，边缘整齐，反光，乳白，不透明澄清,沉淀SL9-1凸起，光滑，有光泽，反光，不透明，边缘整齐，乳白澄清,沉淀SS5-2凸起，光滑，不透明，有光泽，反光，边缘整齐，白色澄清,沉淀SS9-2凸起，光滑，不透明，反光，边缘整齐，乳白色澄清,沉淀SS5-1凸起，光滑，有光泽，反光，不透明，边缘整齐，乳白澄清,沉淀SS7-1凸起，光滑，不透明，反光，边缘整齐，乳白暗淡澄清,沉淀SS7-3凸起，光滑，不透明，反光，边缘整齐，乳白澄清,沉淀SS1-1凸起，光滑，不透明，有光泽，反光，边缘整齐，白色澄清,沉淀C4-1凸起，光滑，有光泽，反光，不透明，边缘整齐，白色澄清,沉淀C8-3凸起，光滑，不透明，反光，边缘整齐，白色澄清,沉淀C7-2凸起，光滑，不透明，反光，边缘整齐（细毛绒状），白色澄清,沉淀PLC1凸起，光滑，反光，边缘稍有绒毛状，菌蹼打，白色稍透明澄清,沉淀PLC3凸起，粗糙，不反光，不透明，细毛绒状，边缘毛绒状，白色澄清,沉淀LKS2凸起，光滑，有光泽，蜡状，边缘不整齐，白色稍暗澄清,沉淀S2L12凸起，粗糙，褶皱，暗淡，边缘整齐，白色较暗，不透明澄清,沉淀SS1-5 凸起，粗糙，有褶皱，不透明，不反光，边缘不整齐，毛绒状，白色暗淡澄清,沉淀SS1-2凸起，光滑，不透明，有光泽，反光，菌蹼大，白色暗淡发黄，稍透明澄清,沉淀筛选出的发酵特性与香气较好的5株酵母菌株的形态学特征图 菌株SL8-1 菌株SL9-1 菌株SS1-5 菌株SS5-1菌株SS9-2图3-1从酵母菌株的形态可以将其初步归类为酿酒酵母，之后再用26SrDNA D1/D2与RAPD分析法确定该5株酵母菌株是否为酿酒酵母。3.2酵母菌株分子生物学鉴定3.2.1酵母菌基因组DNA提取及26SrDNA D1/D2区扩增采用玻璃珠法从供试酵母菌株中提取基因组DNA，其纯度、浓度与完整性均能满足PCR扩增反应要求。PCR扩增后的电泳图谱显示这5株酵母菌株的基因组DNA在500-750之间，与商品酵母菌株的基因组DNA相差不大。 20001000750500100250图3-2 5株酵母菌株26S rDNA D1/D2区序列扩增结果注：从左至右依次为SL9-1， SL8-1， SS1-5 ，SS5-1 ，SS9-2 ，RC212和DL2000 DNA marker3.2.2酵母菌基因组RAPD扩增采用玻璃珠法从供试酵母菌株中提取基因组DNA，之后进行RAPD扩增，以比较该酵母菌株的遗传多样性，扩增结果显示，酵母菌株的遗传差异比较小。图3-3 5株酵母菌株RAPD扩增结果注：从左至右依次为100bp DNA marker， SL9-1， SL8-1， SS1-5 ，SS5-1 ，SS9-23.2.3酵母分离株依据26S rDNA D1/D2序列鉴定结果从葡萄汁发酵液中分离出117株酵母菌株结合26S rDNA D1/D2区域序列分析呀以及各供试菌株26S rDNA D1/D2区序列与模式菌株序列的碱基差异率都在1%之内，将酵母菌株归为6个属分别为酿酒酵母属Saccharomyces，毕赤酵母属Pichia，有孢汉逊酵母属Hanseniaspora，伊萨酵母属Issatchenkia，红酵母属Rhodotorula，长孢洛德酵母Lodderomyces表3-2酵母菌株26S rDNA D1/D2区序列鉴定结果属种菌株与模式菌株的同源相似性（%）GenBank登录号SaccharomycesS. cerevisiaSL1-599.8HM123745SL7-5-2100HM123751C7-2100HM123731SS1-1100HM1237521099.6HM236342PichiaP. kluyveriPLC-399.5HM123743LKS-399.3HM123740LKC-499.5HM123736SL2-1-399.5HM123749C2-199.3HM123730HanseniasporaH. uvarumPLC-1100HM123742LKC-799.8HM123737LKS-2100HM123739SL3-199.8HM123750H. occidentalisSL1-1100HM123744IssatchenkiaI. occidentalisLKS-1100HM123738LKC-299.8HM123735FS1-299.6HM123733SL4-4100HM236344I. orientalisSL1-7100HM123747FS1-199.6HM123732RhodotorulaR. mucilaginosaSL1-699.8HM123746LodderomycesL. elongisporusFS1-3100HM3574693.2.4各个发酵时期与葡萄果皮的酵母菌数分离的到的117株酵母菌株来自葡萄果皮以及发酵液前、中、后期酵母菌数量如下所示。表3-3葡萄果皮及发酵液前中后期的酵母菌株数量菌种名称果皮前期中期后期S. cerevisia0 1036 36H. uvarum6 4 1 0P. kluyveri3 5 1 0H. occidentalis0 1 0 0I. orientalis0 2 0 0L. elongisporus0 1 0 0I. occidentalis2 6 2 0R. mucilaginosa0 1 0 03.2.5酵母系统学发育分析为了显示供试菌株与已知酵母菌种的模式菌株之间的亲缘关系及其系统地位，根据同源序列搜索结果下载同源率高的相关模式株的26S rDNA D1/D2区域序列与已鉴定菌株的 D1/D2区域序列构建系统发育树，在基于26S rDNA D1/D2区域序列分析绘制的系统树上，相同的种被归在一个主分枝内，表明它们具有较近的亲缘关系，而不同的种却位于不同的亚分枝上，显示它们在D1/D2区域序列上具有明显区别。系统发育树的结果与26S rDNA D1/D2序列的分类鉴定结果相一致。图3-4各供试菌株26S rDNA D1/D2区序列系统发育树3.3供试菌株的抗性评价配YPD液体培养基，取8mL分装于口径为18mm的试管，放入倒置的杜氏发酵管，用棉塞封口后包扎，118灭菌20min，备用。用灭菌竹签挑取一定量的菌体接入灭过菌的培养基中置28培养箱中培养，在此期间观察杜氏管内气体集存与否及其积存量，每隔4h观察一次并记录产气情况，连续记录7d，发酵结束后嗅觉评价其气味情况并记录，初步筛选出产气好并有香味的菌株。对21株供试酵母菌株进行了耐酒精性、耐温性、耐渗性、耐高糖性、耐酸碱性和耐SO2六个指标的抗性测定。记录结果如下所示表3-4 21株酵母菌株发酵力测定结果菌株编号起发时间(h)发酵速度发酵气味菌体生长状态SL8-12+浓酒香味沉淀SL5-14+酒香味沉淀SL4-113+浓酒香味沉淀，有膜SL5-23+有酸味沉淀 SL9-13+浓酒香味沉淀SS5-25+酸味沉淀SS9-26.5+淡草香味沉淀SS5-13.5+清香味沉淀SS7-14.5+浓酒香味沉淀SS7-34+酒香味沉淀SS1-112+酒香味沉淀C4-12+酒香味沉淀C8-34.5+淡草香味沉淀C7-25+酒香味沉淀PLC114+酒香味沉淀PLC316+-香草味沉淀，有膜LKS-210+有酸味沉淀S2L1-28+香草味沉淀SS1-2SL1FJ1 SS1-5 101214+酸味浓酒精味香草味沉淀沉淀，有膜沉淀，有膜注：1 起发时间为接种至累计发酵产气0.1mL所需时间，本实验以产气至杜氏管14（约0.1mL）计。2发酵速度：+表示从起发时间起4h内所产气体充满杜氏管；+从起发时间起8h内所产气体充满杜氏管；+从起发时间起12h内所产气体充满杜氏管；+-从起发时间起12h后所产气体充满杜氏管。3.3.1酒精耐受性当酒精浓度为6.0%（vol）时，除酵母菌株SS1-2生长缓慢外，其他菌株均可正常生长，并有17株可发酵产气。当浓度为8.0%（vol）时生长明显下降且只有16株可发酵产气，当酒精浓度为12.0%（vol）时有15株可以生长，当酒精浓度14.0%时有11株菌株可以生长并且能发酵产气，当酒精浓度为16.0%时所有的菌株都不能发酵，有11株菌株可以生长。表3-5 21株酵母菌株的酒精耐受性菌株编号乙醇（%）Vol6.08.010.012.014.016.0SL8-1/ F+/F-/F-/F-SL5-1/F/F-/F-/F-SL4-1/F/F-SL5-2/F/ F-/F-/ F-/F- SL9-1/F+/F+/F+/F+/F+SS5-2/F/F/F/F/ F-SS9-2/F+/F+/F+/F+/F+SS5-1/ F+/F-/F-/F-/F-SS7-1/F/F-/F-/F-/F-SS7-3/F+/F/F/FSS1-1/F/ F-/F-/ F-/F-C4-1/F+/F+/F+/F+C8-3/ F+/ F-/F-/ F-/F-C7-2/ F+/ F-/F-/ F-/F-PLC1/F+/F+/F+/F+/F+PLC3/ F-LKS-2/ F-/ F-/ F-/ F-/ F-S2L1-2WSS1-5 SS1-2SL1FJ1注：表示生长；：表示不生长；W:表示生长的弱；F+ ：表示发酵24h内杜氏管充满气体；F+ ：发酵48h内杜氏管充满气体；F+：发酵72h内杜氏管充满气体；F：发酵96h内杜氏管充满气体；F-：发