质谱技术(2006).ppt

第三章质谱技术 Massspectrum MS 内容 第一节质谱学基础第二节高效液相色谱 质谱联用第三节生物质谱简介 第一节质谱学基础 什么是质谱质谱仪的基本结构质谱仪的主要性能指标质谱图及其判读 第二节高效液相色谱 质谱 HPLC APIMS HPLC ESIMS 电喷雾电离 HPLC APCI 大气压化学电离 HPLC APPI 大气压光致电离 HPLC APIMS方法开发 LC MS联用所面临的两大问题 液相色谱流动相的量比质谱所能忍受的量大得多 典型流量是1mL min 气化后相当于气体流速150 1200mL min 而现代质谱只能忍受的气体流量只有1 20mL min 液相色谱的研究对象是难挥发和热不稳定的化合物 这些化合物用常规电离方法是很难电离的 关于LC MS的研究主要致力于解决上述两个问题 LC MS电离技术的相对适用性 HPLC ESIMS 电喷雾电离 检测器 喷雾室 离子阱 电喷雾电离源API ElectrosprayIonSource 高电压装置 电喷雾电离 离子形成的必要步骤 步骤1溶液中的电离样品的pKa溶液的pH步骤2喷雾表面张力和粘度气动辅助步骤3去溶剂干燥气温度和流速热容量 Hvap步骤4离子从溶液中解吸溶解能步骤5气相中的离子反应质子亲合力电荷交换 步骤1 在溶液中如何产生离子 离子种类NH4 PO4 酸 碱化学性质M NH2 酸 M NH3 酸 正离子检测 M COOH 碱 MCOO 碱 负离子检测 缔合 对类似糖的中性物质 M Na M Na 碱金属 如20mM乙酸钠 衍生化形成离子或酸 碱产物 步骤2 气动辅助电喷雾 产生带电液滴 含有约100 000电荷 直径2 m的带电溶剂液滴 由于溶剂组成或流速 气动喷雾减小了液滴的大小对粘度和表面张力的偏离 喷雾柱体 端板和毛细管上的场使液滴带电 步骤3 带电液滴的去溶剂 热干燥气体 加热的氮气蒸发了液滴 增加了电荷 体积比 Rayleigh极限是带电液滴能够存在的最大电荷 体积比 当电荷超过这个极限时 发生库仑破裂 液滴的Con t库仑分裂 Rayeigh破裂释放出较小的最终变成样品离子的液滴 50 100nm带电液滴 包含100个电荷 这些液滴包含母体液滴中10 20 的电荷但仅仅2 的质量 步骤4 从溶液中解吸离子 当液滴的场强超过分析物在溶液中的溶解能时 离子解吸进入气相 带电残余物 离子蒸发 蒸发 Rayleigh极限 Coulomb爆裂 蒸发 被分析离子 步骤5 气相中的离子反应 通过离子传输区域时从大气压喷雾室的反应中会发生质子转移和电荷交换反应 这个高压区允许发生1000次离子 分子反应 质子转移 气相质子转移反应使分子带电 M NH4 M H NH3 电喷雾喷雾室设置 样品在溶液中为离子态 儿茶酚胺 硫酸酯共轭物 丁基胺有可诱导电离的化合物 甲醇含杂原子的化合物 氨基甲酸酯类 苯并二氮杂草类溶液中带多电荷 蛋白质 多肽 低聚核甘酸溶液化学参数流速样品的pK 溶液pH溶液导电性应避免的样品尤其非极性的样品 PAHs PCBs 电喷雾需考虑的问题 HPLC APCI 大气压化学电离 APCI离子化机理 APCI离子化机理 气化 溶剂电离 电荷交换给分析物N2 从干燥气 e N2 2e N2 2N2 N4 N2N4 H2O H2O 2N2H2O H2O H3O OH H3O M M H H2O APCI离子源 电晕针 HPLC流速 500 L min雾化气压力60psig干燥气温度startwith350 C干燥气流速4L min气化温度随FIA调节帽电压随FIA调节 2000 6000 开始2500V电晕电流随FIA调节开始25 A neg 或4 A pos APCI喷雾室的设置 样品分子量和极性中等的化合物 PAHs PCBs 脂肪酸 邻苯二甲酸酯类 不含酸性和碱性位点的化合物 碳氢化合物 醇 醛 酮和酯 含有杂原子的化合物 脲 苯并二氮杂草 氨基甲酸酯 具有一定挥发性的化合物 排除了分子量较大和极性较大的分子 如蛋白质 多肽 电喷雾响应不好的样品 溶液化学参数较ES对溶液化学作用不灵敏较ES更耐大的流速适用ES不宜的一些溶剂应避免的样品在气化过程中热不稳定的化合物 APCI需考虑 电喷雾电离 其电离过程通过电场产生带电液滴 接着样品离子通过离子蒸发后 进行质谱分析 适用于在溶液中为离子态或可诱导电离的化合物 适用于分子量较大和极性较大的分子 如蛋白质 多肽 大气压化学电离 APCI 气相化学电离 CI 过程中溶剂相当于CI反应气来使样品电离 适用于分子量和极性中等的化合物和具有一定挥发性的化合物 排除了分子量较大和极性较大的分子 小结 HPLC APIMS方法开发 HPLC MS用途 成份确认或定性及半定量 如合成产物分析 FIA无光谱吸收物质的定量低含量和色谱未分离成份的测定 如杂质检查 SIM LC条件优化未知样品的分析 如中药分析 与DAD结合 Multi channeldataacquisition大分子样品分析 pH至关重要 样品前处理质谱检测条件检测离子模式 离子化参数设定液相色谱条件ESI液质分析APCI液质分析样品导入方式Infusion HPLC FIA柱后修饰技术 样品前处理 了解样品情况种类纯度或含量 溶解度 存储条件 挥发性 热稳定性分子结构 pK值 pI值影响LC MS分析的主要因素盐背景或基质成份 离子化 浓度 ng ml dimer真空度 溶剂雾化 质谱条件 离子源选择 1 ESI待测物无需有挥发性热不稳定成份首选离子在溶液中已形成形成单电荷离子和多电荷离子流速 750 L min APCI待测物需有一定挥发性待测物对热稳定离子在气态中形成只形成单电荷离子流速 500 L min 质谱条件 离子源选择 2 ESI在溶液中已是离子态catacholamines sulfateconjugates quaternaryamines含杂原子化和物carbamates benzodiazepines带多电荷成份proteins peptides oligonucleotides对APCI响应弱的物质 APCI中等分子量和中等极性成份PAHs PCBs fattyacids phthalates alcohols aldehydes ketones etc 含杂原子化和物carbamates benzodiazepines对ESI响应弱的物质 质谱条件 离子模式选择 正离子ES模式 适合于碱性样品 amines amides aminoacids antibiotics etc有杂原子 N2 O2 可接受H Na NH4 如NH2 N NH CO COORpH N2 可失去质子 COOH SH NO2pH pK 2可正可负 比较灵敏度 质谱条件 API参数设定 ESI Foraqueouslevelsabove50 APCI Goodsensitivityatabove500 l min 需优化 液相方法转为液质联用需要考虑 色谱分离和待测物离子化待测物的离子化能力流动相及流速与质谱的匹配性色谱柱与质谱的匹配性 色谱柱流动相流速 液相条件 选择相应的色谱柱 液相条件 色谱柱内径选择 ESIFlowrate 1 1000 l min1 0 2 1 3 0mmid建议用2 1mm浓度相关反相流动相 APCIFlowrate 50 1500 l min4 6 3 0 2 1mmid建议用4 6mm浓度不相关 进样多 信号强反相和正相流动相 液相条件 色谱柱颗粒度选择 5 mParticles扫描模式widerpeakwidth简单样品 3 5 mor ParticlesSIM 增加灵敏度增加分辨率缩短分析时间复杂样品等度组份 液相条件 色谱柱长度选择 短柱 15 75mm 缩短时间SIM Multipleionmode简单样品易区别分子量 长柱 150or250mm 提高分离效果扫描模式Multiple ionmode复杂样品等度分离 液相条件 流速 ESI浓度敏感微径柱得到更高灵敏度最佳工作流量 100 500 l min柱后添加调节离子化效率色谱未能分离的组份 可用萃取离子模式进行定量 APCI质量流量敏感柱内径对灵敏度的影响极小最佳工作流量 500 1500 l min可用正相色谱色谱未能分离的组份 可用萃取离子模式定量 液相条件 与API MS匹配的溶剂 ForESIandAPCIMethanolEthanolPropanolIsopropanolButanolAcetonitrileWaterDMFDMSOAcetoneCH2Cl2CHCl3 ForAPCIonlyTolueneBenzeneHydrocarbons e g Hexane StyreneCCl4CS2CyclicHydrocarbons e g Cyclohexane 强挥发性 不易形成加和物介电常数适中 避免喷口放电显著质子自递作用 液相条件 常用缓冲盐 挥发性 ForESIandAPCIAceticacid pH3 8 5 8Ammoniumacetate pH6 7Ammoniumformate pH5 6Ammoniumhydroxide pH8 2 10 2FormicacidHeptafluorobutyricacidTriethylamineTetrabutylammoniumhydroxideTetraethylammoniumhydroxide HPLC条件 液相分离模式 ModeESIAPCIReversedPhase Normal SizeExclusion IonPair IonExchange Hydrophobic InteractionImmunoaffinity LC和MS的匹配 ESI需要在溶液中形成离子 但造成反相色谱保留效果差 高离子强度和非挥发性缓冲对ES模式是不利的 第三节生物质谱简介 生物质谱技术 bio massspectrometry 目前已成为蛋白质组学 基因功能组学等生命科学前沿研究的重大技术平台之一 它是根据生物大分子的化学结构特点 采用软电离技术和以计算机为基础的专用分析软件 能快速 定性 定量地测定分析生物样品 由于ESI和MALDI两种技术的出现 使得在pmol 10 12mol 乃至fmol 10 15mol 水平检测相对分子质量达到十万的生物大分子成为可能 生物质谱分析过程 MassSpectrometry DatabaseSearch 1 3 4 Massspectrometry MS tocharacteriseproteinspots 5 Databasesearchestoidentifyproteins 2 2D PAGEtoseparateproteins 3 Imageanalysistodeterminethevolumeofproteinspots 2D PAGE ImageAnalysis 2 4 1 Extractsample 2DGelPrinciples SDSPAGE IonizationMethods 370nmUVlaser MALDI cyano hydroxycinnamicacid Goldtipneedle Fluid nosalt ESI 生物质谱的应用 蛋白质和多肽的一级结构分析分子量测定肽谱测定肽链中氨基酸序列分析核酸相对分子量测定和测序多糖结构分析 多电荷质谱图的解析 反卷积 Deconvolute 绿色荧光蛋白质MW27kDa的质谱图 确定电荷状态 假设m1和m2这一对离子是同一离子的两个电荷状态 n1和n2 这里n2 n1 1假设加合离子质量x H 在这个例子中 质量 1 对二个离子计算电荷状态n2 如果这些峰相关 它必定为整数 n2 m1 x m2 m1 694 0 1 867 3 694 4n2 4 确定多电荷离子的电荷状态 计算分子量 M若X H 1 0M n2 m2 x 4 867 3 1 3465 2对另一对峰重复计算n2 578 5 1 694 0 578 5 5M 5 694 0 1 3465 0如果满足下面条件 则另一对离子是相关的 在满足前面一对离子的正确的系列中计算出整数电荷状态计算出的分子量与前面一对离子得到的分子量足够相近 确定多电荷离子的分子量 反卷积过程 以人类生长激素为例 MW22125 7 对目标预期分子量选择加合离子和参数 选择反卷积参数 蛋白质 分子量 3000 对目标预期分子量选择加合离子和参数 选择反卷积参数 蛋白质 分子量 3000 选择反卷积参数 概要 点击反卷积 质谱图 Deconvolute MassSpectra 在谱图中找到多电荷成分 反卷积 Results 点击反卷积 查看 Deconvolut