二代测序技术在非小细胞肺癌中的临床应用.ppt

NGS技术在非小细胞肺癌精准治疗中的应用 目录 1 2 3 DNA测序技术简介 非小细胞肺癌精准治疗概述 NGS检测技术贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程 DNA测序技术简介 PART01 DNA测序技术的发展历程 一代测序技术 二代测序技术 NGS 三代测序技术 化学降解法双脱氧链终止法 Sanger法 荧光自动测序技术杂交测序技术 Roche公司的454测序技术Illumina公司的Solexa技术ABI公司的SOLiD技术Life公司的IonTorrent技术 Helicos公司的Heliscope单分子测序仪PacificBiosciences公司的SMRT技术OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术 孙海汐 王秀杰 DNA测序技术发展及其展望 J 科研信息化技术与应用 2009 03 18 29 20世纪中叶至20世纪末 2005年至今 2008年至今 各大DNA测序技术的比较 DNA二代测序技术 Nextgenerationsquencing NGS 的应用 A B D E C 2009年 NGS用于罕见遗传病分子病因学研究和诊断 遗传病 2008年首次报道NGS应用于急性髓细胞性白血病 此后NGS被广泛应用于肿瘤领域 2014年 NGS技术应用于血浆ctDNA检测 2017年11月 FDA批准首个肿瘤多癌肿多基因检测平台MSK IMPACT 2017年12月 FDA式批准了首个NGS体外诊断 IVD 上市 肿瘤 2013年 NGS应用于人类胚胎细胞非整倍体筛查的临床前研究 胚胎植入前遗传学诊断与筛查 2008年 华大基因尝试用NGS检测胎儿游离DNA2010年 基于NGS的无创产前筛查开始进入临床 无创产前DNA检测 非小细胞肺癌精准治疗概述 PART02 在中国 肺癌的发病率及死亡率均居第一位 陈万青 等 2013年中国恶性肿瘤发病和死亡分析 J 中国肿瘤2017 26 1 1 7 肺癌从单病种 组织分型 分子分型的演变 肺癌分为非小细胞肺癌 NSCLC 和小细胞肺癌 SCLC 两大类 NSCLC约占85 主要分为肺腺癌 肺鳞癌和大细胞癌等 肺腺癌约占NSCLC40 50 肺鳞癌约20 30 大细胞癌约1 5 NSCLC不再是一个疾病 而是一组疾病 需要分类治疗 分子分型是关键 XuYetal TherClinRiskManag 2016May24 12 807 16Shamesetal JPathol 2014Jan 232 2 121 33LiT etal JClinOncol 2013Mar10 31 8 1039 49 HerbstRSetal Nature 2018Jan24 553 7689 446 454 欧美人群与中国人群NSCLC的分子特征有所不同 HerbstRS等2018年1月发表于 Nature 的综述中指出欧美人群中 肺腺癌中常见激活突变位于PI3K AKT mTOR和RAS RAF两大信号通路 包括癌基因EGFR KRAS ERBB2 3 MET ALK RET ROS BRAF等 失活突变包括抑癌基因TP53 KEAP1和NF1等肺鳞癌中常见激活突变包括癌基因FGFR1 3 PIK3CA KRAS AKT BRAF等 较少见EGFR扩增 失活突变包括抑癌基因TP53 CDKN2A 欧美人群与中国人群NSCLC的分子特征有所不同 Oncotarget 2016Jul5 7 27 41691 41702 A 1770例中国NSCLC患者测序结果显示常见激活突变包括癌基因EGFR KRAS ALK ERBB2 HER2 MET RET BRAF ROS1等 其中EGFR突变比例为50 3 占据NSCLC突变半壁江山 远高于欧美人群27 B 904例非吸烟肺腺癌患者测序结果显示常见激活突变包括癌基因EGFR ALK KRAS ERBB2 HER2 MET RET BRAF ROS1等 其中EGFR突变比例高达74 5 表明EGFR基因在中国肺腺癌患者中至关重要 肺癌进入精准治疗时代 根据分子分型决定治疗方案 DeborahBetal JAMAOncol2018Apr01 4 4 NGS二代测序 ddPCR数字PCR ARMS PCR FISH荧光原位杂交 IHC免疫组化 01 02 03 04 05 临床常用的分子检测诊断技术 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性 定位或定量研究 扩增阻碍突变系统 ARMS 利用PCR引物的3 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理 设计等位基因特异性PCR扩增引物 只有在引物3 碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带 野生型的不扩增 通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交 并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术 通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交 并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术 在Sanger测序方法的基础上 用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP 当DNA聚合酶合成互补链时 每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光 根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理 从而获得待测DNA的序列信息 临床常用的分子检测诊断技术优劣势比较 CAP IASLC及AMP三大权威机构推荐由单基因检测发展为多基因检测 JMolDiagn 2013Jul 15 4 415 53 JMolDiagn 2018Mar 20 2 129 159 2013 2018 近年NCCN指南均建议进行广泛基因检测 传统分子检测方法存在局限性 NGS平台能够全面满足NSCLC现有分子检测诊断需求 NGS检测技术贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程 PART03 NGS检测贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程 NGS ctDNA有助于肿瘤的早期发现 JillianPhallenetal SciTranslMed 2017Aug16 9 403 Jillian运用基于NGS平台的目标错误校正测序 TEC Seq 方法 对ctDNA的序列变化进行超灵敏的直接评估发现 健康人群中未检出肿瘤特异性基因突变 以健康人作为对照 乳腺癌 肺癌 卵巢癌 结直肠癌患者都检测到了肿瘤特异性突变 早期肿瘤就能够检出肿瘤特异性基因突变 检测肿瘤特异性基因突变与癌症的临床分期呈正比Jillian认为基于NGS平台的TEC Seq分析方法为早期肿瘤的无创检测提供了广泛适用的方法 可能对癌症患者的筛查和管理有用 提示ctDNA用于常见癌种早期诊断的可能性 CSCO指南认可NGS在非小细胞肺癌分子分型的作用 中国临床肿瘤学会指南工作委员会 中国临床肿瘤学会原发性肺癌诊疗指南2018版 NGS有助于分析非小细胞肺癌分子分型演讲 指导后续治疗 英国TRACERx肺癌研究计划的首个成果2017年发表于 新英格兰医学杂志 其中提到 NSCLC腺癌 进化 的早期 诸如EGFR MET BRAF和TP53之类基因的突变 扩增往往发生在克隆水平 这些基因往往与NSCLC的形成有关 属于驱动基因NSCLC 进化 的晚期 75 的肿瘤出现了亚克隆水平的各种变异 而且这些变异还位于肿瘤的不同区域 是造成肿瘤内部异质性的原因 M Jamal Hanjanietal NEnglJMed 2017Jun1 376 22 2109 2121 早期 晚期 NGS指导非小细胞肺癌个体化用药及疗效预测 Tsaoetal JThoracOncology Vol 11No 5 613 638 DeborahBetal JAMAOncol2018Apr01 4 4 晚期非小细胞肺癌药物治疗靶向 免疫 化疗三分天下 此时基于NGS平台的多基因检测优势明显 NGS指导非小细胞肺癌个体化用药及疗效预测 RizviNA HellmannMD etal Science 2015 348 6230 124 128 Rizvi对非小细胞肺癌 NSCLC 进行全外显子测序 发现肿瘤中更高的非同义突变负荷 H TMB 人群有更好的无进展生存期 PFD 并且对PD 1单抗 pembrolizumab 有持久的反应 DCB NGS能够帮助发现非小细胞肺癌耐药机制及判断预后 KeEE等纳入224名EGFR突变并获得EGFR TKI耐药的晚期NSCLC患者 分析T790M突变 MET扩增 组织学转化 KRAS PIK3CA突变 ALK融合等耐药机制 其发现 19 del缺失组的T790M突变 50 4 显著比L858R突变组 36 5 高 T790M突变的患者中观察到明显的OS益处 中位OS36 0个月 在调整T790M基因型的多变量分析中 EGFR突变亚型不再被认为是显著的 结果报道 EGFRT790M高比例突变对于Exon19缺失比L858R突变的患者有更好的存活率 预后更好 KeEE etal JThoracOncol 2017Sep 12 9 1368 1375 NGS ctDNA早期提示肿瘤复发 ChaudhuriAA etal CancerDiscov 2017Dec 7 12 1394 1403 ChaudhuriAA等采用深度测序 CAPP seq 循环肿瘤DNA ctDNA 分析方法 对40例I III期肺癌患者和54名健康成人的255份样本进行了癌症个性化监测 其发现 94 的患者在治疗后的血液样本中检测到ctDNA定期接受ctDNA监测的患者 在接受根治性治疗后 第一次检测到ctDNA的时间 比CT明确提示肿瘤复发 平均提前了5 2个月ctDNA中相应基因检测 还可以用来区别到底是疾病复发还是正常术后改变 NGS正在以更高的标准 快速进入临床服务患者 FDA自2016年底至今已批准6款NGS技术产品 以期降低NGS技术产品潜在的检测错误和解读错误风险 保证该类产品检测的安全性 有效性 2016 12 19FoundationFocus CDxBRCABRCA1 2晚期卵巢癌Rucaparib 2017 6 22Oncomine DxEGFR ROS1 BRAF非小细胞肺癌吉非替尼 克唑替尼 达拉菲尼 曲美替尼 2017 6 29Praxis ExtendedRASPanelKRAS exons2 3 4 NRAS exons2 3 4 转移性结直肠癌帕尼单抗 2017 11 15MSK IMPACTTMFFPE样本的468个基因MSI MMR所有实体瘤补充诊断 2017 12 1FoundationOneCDx FFPE样本的3