基础步骤.doc

1 养菌1.保存的菌种在lb培养基(不含amp)上划线2.37培养24h至长出菌落。3.摇菌无菌试管内加入7ml LB培养基，挑取单菌落加入培养基中，37，200rpm摇菌21-24h二感受态细胞CaCl21前夜接种受体菌，挑取单菌落于LB培养液中37摇床培养过夜（约16小时）；2取1ml过夜培养物100ml LB培养液 37摇菌2.5-3小时（250-300rpm）；3将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；41.5ml菌液至1.5ml离心管 冰上冷却10-15分钟；54下3000 g冷冻离心5分钟；6弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；74下3000 g冷冻离心5分钟；8弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。1 转化（1）加入2ul质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10l）+50l（稀释）感受态细胞 冰浴40分钟（2） 42水浴浴锅80秒 冰上冷却2-3分钟。（3） 培养液（不含Amp）650微升 （瓶口灭菌）（4） 摇菌30分钟 200-250转（5） 离心 1分钟 5000转（直接取100微升菌液接种）（6） 去上清液，留少许 混匀（7） 接种环+培养皿含Amp的筛选平板 生化培养箱35.1（8） 生出菌（9） 枪头取菌 +10毫升培养液（瓶口灭菌）+10微升青霉素（10） 摇菌13-14小时 250转 373. 提取质粒离心管（1）菌1500微升 离心1分钟，5000rpm 弃上清液（重复一次）（2）250微升 溶液（冰）打散菌块（3）250微升 溶液 放置小于5分钟 颠倒4-5次（4）350微升 溶液 放置小于10分钟 颠倒4-5次（5）13000rpm 离心10分钟 准备纯化柱（6） 换纯化柱离心30-60秒 弃清液（7） 缴入750微升溶液 离心30-60秒 （洗去杂质，弃液体）（8） 离心1分钟 去残留的液体（9） 质粒纯化柱固体（蓝） 1.5微升离心管+50微升溶液放置1分钟（10） 离心13000rpm 1分钟 高浓度质粒4 跑电泳（制胶）（1）0.2克电泳制胶粉末 小梳 10微升（EB替代品，DNA染色剂）（2） TB20毫升（3） 5微升DNAlodding 第一格 对比 8微升质粒+2微升lodding（4） 90v 电泳30分钟5 PCR扩增（1）0.2毫升PCR微量离心管中配置50毫升反应体系（2） DDWATER 34微升（3） 10PCRbuffer（不含mgcl2) 5微升（4） （10mmol) 2.5mmol/LdNTP 5微升（每种dNTP浓度0.2mu)反应体系（5） （20umol） 10umol/LPrimer 1 2ul(12.5-25pmoles)（6） （20umol） 10umol/LPrimer 2 2ul(12.5-25pmoles)（7） 模板质粒 1.5ul(0.001Pmoles) 优化条件（8） 5u/ul Tap酶 0.5ul（3u） 电泳检测总体系 50 ul操作（1）94 5分钟（2）94 1分钟（3）60 1分钟（4）72 110秒（5） goto (2) 29times（6） 72 10minPCR结束后 取10 ul产物进行琼脂凝胶电泳6 培养液配置1L 10gTRYPTONE 蛋白冻 5gYEAST EXTRACT酵母提取物 5-10gNacl （10-15g琼脂粉）10mol/L 100ul NaoH (调节PH到7.0)配置好后置灭菌箱中灭菌 Star