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发色剂亚硝酸盐的检测技术及研究进展 后附火腿、香肠中亚硝酸盐含量测定摘要：亚 硝 酸 盐 是 一 种 典 型 的 发 色 剂，广 泛 存 在 于 水 体 和 食 品 中，可在人体内与仲胺、叔胺和氨基化合物反应形成强致癌物亚硝胺化合物，因此对亚硝酸的检测是十分必要的。本文综述了近年来国内外亚硝酸盐检测方法研究现状，主要包括光度法、电化学法、色谱法，并对未来检测方法提出了展望。关键字：亚硝酸盐；检测技术；发色剂1 引言发色剂又称护色剂，是能以肉及肉制品中呈色物质作用，使食品加加工、保藏等过程中不被分解和破坏，呈现良好色泽的物质。常用的发色剂有硝酸盐或亚硝酸盐。由于研究发现腌肉中的亚硝酸盐能生成致癌物质亚硝胺，因而硝酸盐和亚硝酸盐的使用引起争议，但一般认为只要控制好使用量，就不会达到中毒员的程度，相反还能达到抑制微生物和产生特殊风味的作用，因而认为是人可取代也无须取代的物质，甚至认为在人的唾液、胃液中，也存在亚硝基物质，许多天然植物(如菠菜)也存在亚硝基物质，只要不达到足够的量，对人体应该是安全的。然而很多不法分子为改善食品的色泽，恢复食物原来的颜色，而在腌肉等食品中加入过量的亚硝酸盐、硝酸盐等发色剂，严重地危害了消费者的人生安全。因此寻找一种快速，准确测定食品中亚硝酸盐含量的检测技术势在必行。2 亚硝酸盐的发色原理亚硝酸盐本身并无着色能力，但其与肉中的乳酸发生复分解反应而生成亚硝酸，亚硝酸很不稳定容易分解产生氧化氮，氧化氮与肌肉纤维细胞中的肌红蛋白结合而产生鲜红色的亚硝基肌红蛋白，也可与血红蛋白形成亚硝基血红蛋白，使肉制品保持稳定鲜艳的红色。3 亚硝酸盐的检测技术3.1 光学分析法光学分析法主要是根据物质发射、吸收电磁辐射以及物质与电磁辐射的互相作用来进行分析的在亚硝酸盐的测定中主要有：可见光分光光度法、催化光度法、荧光光度法。3.1.1 可见光分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定量分析的方法利用苯胺作重氮化试剂、-萘酚为偶联剂对分光光度法测定肉制食品亚硝酸盐含量进行了研究。结果显示偶联产物的最大吸收波长为480 nm，NO2-的检出限为00.004mg/mL用盐酸萘乙二胺比色法分别测定5种腌制食品中亚硝酸盐的含量。通过单因素试验及正交试验得到相对标准偏差为0.04%2.76%，回收率为97.6%100%。选择了毒性小的8-羟基喹啉作为偶氮试剂，在碱性条件下与重氮化合物偶合成橙红色染料，建立了测定亚硝酸盐的新方法。在波长为500 nm处具有最大吸收，亚硝酸盐含量在00.8 g / mL 范围内。3.1.2催化光度法催化光度法是在常规的分光光度法的基础上发展起来的高灵敏度光度法。在稀磷酸介质中, 用氯化十六烷基三甲基铵对亚硝酸根催化溴酸钾氧化甲基红褪色反应的增敏作用, 建立了测定痕量亚硝酸根的增敏催化动力学光度法。测定亚硝酸根的线性范围为5.0300g/L, 检出限为0.59g/L, 方法的相对标准偏差优于2%, 标准加入回收率为99%101%。基于磷酸介质中的亚硝酸催化溴酸钾氧化甲苯胺蓝的褪色反应，建立了在室温下光度法测定痕量亚硝酸根的方法。实验表明在622 nm 有最大吸收波长，线性范围为0.010.12 mg / L，检出限为4.810-7g / L。3.1.3 荧光光度法荧光光度法测定亚硝酸盐是基于亚硝酸盐对于氧化还原反应的催化作用，使指示物质的荧光强度减弱或猝灭，通过测定荧光强度的变化来测定亚硝酸根含量基于盐酸介质中，在常温下亚硝酸根能与劳氏紫发生重氮化偶联反应，劳氏紫的荧光强度随亚硝酸根的加入量增加而明显降低的现象，建立了荧光猝灭法测定痕量亚硝酸根的方法，测定亚硝酸根的线性范围为0.040.4 mg / L。基于稀磷酸介质中，用溴酸钾氧化吖啶橙使之褪色并伴随着吖啶橙荧光强度减弱。亚硝酸根的存在对该反应可起到显著的催化作用，使反应的灵敏度明显提高，体系的荧光猝灭程度加强。该方法亚硝酸根测定的线性范围为0.055 ng/mL，亚硝酸根的检出限为0.012 ng/mL。 3.2电化学分析法电化学分析法是根据溶液中物质的电化学性质及其变化规律，建立以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质某些量之间的计量关的基础之上，对组分进行定性和定量的仪器分析方法。3.2.1伏安分析法电位法测定亚硝酸根离子是基于亚硝酸的氧化来进行测定的。将多壁碳纳米管分散在镱杂多酸盐溶液中，将获得的悬浊液滴涂在玻碳电极表面，制备了镱杂多酸盐/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极。采用交流阻抗法对电极表面的性能进行了表征，采用循环伏安法对其电化学性能进行研究。研究发现亚硝酸根在该修饰电极上出现一个氧化峰，氧化峰电位在-0.45V处，提出了用循环伏安法测定亚硝酸根的方法。亚硝酸根的浓度在5.010-61.010-4mol/L范围内。氧化峰电流与其浓度呈线性关系。3.2.2示波极谱法极谱法是通过测定电解过程中所得到的极化电极的电流-电位曲线来确定溶液中被测物质浓度的一类电化学分析方法。研究了一种选择性高、准确度和精密度均好的示波极谱法测定痕量亚硝酸根的新体系。此法基于甲基紫与亚硝酸根间发生反应生成的新物质在示波极谱上有新的波峰产生-0.75V处的波高与亚硝酸根的浓度成线性关系，亚硝酸根的检测限为2.010-7g/mL。研究了测定蔬菜中亚硝酸盐的新方法。该方法采用示波极谱法测定亚硝酸盐。结果得出亚硝酸盐的检出限为0.012g/ml，线性范围为0.05g/m1.50g/ml,变异系数为2.1%4.0%，样品加标回收率为95.0%107.0%。3.3色谱法色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以固定相对流动相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。3.3.1气相色谱法气相色谱的分离原理是利用不同物质在两相问具有不同的分配系数，将各组分分离开来建立一种气相色谱测定食品中亚硝酸盐的方法，采用顶空法进样技术，用气相色谱进行定量测定。该方法测定亚硝酸盐的最低检出限为0.86g；若取样5g，则最低检出浓度为0.43mg/kg，线性范围1.2g-1200g采用在硫酸介质中亚硝酸与环己基氨基磺酸钠反应生成环己醇亚硝酸酯，环己醇亚硝酸酯在常温下成气态，顶空进样系统自动进样，气相色谱仪FID进行定量检测，建立葡萄酒中亚硝酸盐的气相-顶空检测方法，最低检出限为0.5 g/mL。3.3.2高效液相色谱法高效液相色谱法具有高效、高速、高灵敏度、操作方便等优点。探讨了食品中亚硝酸盐含量的重氮化偶合高效液相色谱测定方法。食品样品除去蛋白质、脂肪后，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与N-1-萘基乙二胺偶合，之后进行HPLC分析。以SB-C18柱为分离柱，VWD和DAD为检测器，乙酸溶液(14%)/甲醇(80:20)为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为544nm，进样20L。在101000ng/mL范围内，亚硝酸盐含量与峰面积呈良好线性关系(r=0.9997)。方法最低检测浓度为40g/kg。3.3.3离子色谱法离子色谱法是一种特殊的液相色谱。建立了离子色谱测定豆奶粉中亚硝酸盐的含量的方法。样品用去离子水提取，固相萃取后，采用离子色谱法测定豆奶粉中硝酸盐、亚硝酸盐的含量。结果表明：亚硝酸盐的线性范围分别为125mg/mL，回收率分别为89.6%102.0%，检出限分别为0.11mg/kg。建立了离子色谱法测定火腿肠中的硝酸盐和亚硝酸盐含量的方法。利用纯水萃取火腿肠中的亚硝酸盐,经过煮沸、冷冻、过滤后进样测定。经过多次实验,该方法样品加标回收率为96%99%，标准曲线的相关系数为0.9990。建立了用离子色谱法/电导检测器测定蔬菜和水果中亚硝酸盐和硝酸盐的方法。优化了分离条件，以3.5mg/LNa2CO3和1.0mg/LNaHCO3为淋洗液。测定亚硝酸根的相对标准偏差为1.5%，回收率为97%102%。3.4其他分析法发现在波长为567 nm处的共振光散射强度降低与亚硝酸根浓度在一定范围内呈线性关系，从而建立了共振光散射法测定痕量亚硝酸根的新方法。该方法的线性范围为2.010-82.810-7g/mL，检出限为9.3410-9g/mL，回收率为95.5%98.6%。用镉柱还原法测定了20余种蔬菜的硝酸盐与亚硝酸盐的含量。并对人的适宜摄入量进行讨论。以溴离子(Br-)为内标，建立了毛细管离子电泳同时测定腌菜中的硝酸根和亚硝酸根的方法。同时讨论了缓冲液pH、样品和缓冲液中氯化钠浓度、分离电压对分离的影响。结果表明NO2-检出限分别为0.3 g/L，峰面积相对标准偏差分别5.8%。4总结光度法简便、快速、灵敏度高、价格低廉、容易普及，但干扰因素较多，选择性较差，结果的偏差较大。电化学法的灵敏度高、分辨率好、操作简单，但分析结果较为复杂。色谱法具有高效、高速、高灵敏度、操作方便等优点，但测定范围较窄，实验方法较复杂。5展望亚硝酸盐严重威胁着人们的身体健康，因此对亚硝酸盐分析方法的研究与改进将会继续得到人们的高度重视。随着分析化学新方法和新技术的不断出现和发展，亚硝酸盐的检测方法也更加多元化，新的检测方法层出不穷。目前用于亚硝酸盐含量的测定方法有多种，各种方法都有其优缺点。随着亚硝盐研究的深入，极低含量的检测成为必然趋势，未来的亚硝酸盐检测方法可能是联用技术得到广泛的应用，因为联用技术可以实现自动化分析，相互取长补短，充分发挥各自优势，显著提高食品中亚硝酸盐含量的测定，大大地提高样品分析效率。火腿、香肠中亚硝酸盐含量测定硝酸钠是肉制品中常用的添加荆，也是一种毒性较强的化学物质。亚硝酸盐是国家列入允许使用的食品添加剂，肉类制品中用的发色剂主要是亚硝酸盐和硝酸盐，使得火腿、香肠、腊肉等肉类食品在亚硝酸盐作用下，肉品能保持鲜艳的亮红色，同时还具有较强的抑菌作用。研究表明，亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，它可诱发人体胃癌、肠癌、食道癌等疾病过量食用会对人的身体造成危害。通过分析香肠中的亚硝酸盐的含量，建立亚硝酸钠快速检测手段。【方法采用分光光度法确定最佳吸收波长，根据最佳吸收渡长，检测不同食用方法的香肠中亚硝酸钠的含量。1材料与方法11供试食品火腿肠(样品1)，烤肠(样品2)。12主要仪器与试剂121主要仪器。UV7504型紫外分光光度计JY 2502型电子分析天平 HWSY21一K型电热恒温水浴锅122主要试剂。04对氨基苯磺酸溶液，02盐酸萘乙二胺溶液，50饱和的硼砂溶液，22O乙酸锌溶液，106亚铁氰化钾溶液，54110(-6)gml亚硝酸钠标准溶液。13亚硝酸盐标准曲线的绘制131亚硝酸盐的最大吸收波长的测定。用移液管吸取0、3.0、4.0、5.0ml亚硝酸钠的标准使用液，分别置于50ml容量瓶中，再加入20 ml 04对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3 min，然后加入10 ml 02盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀配置成亚硝酸钠浓度分别为0、0324、0432、o540，静置15 min后，2 h内波长在470560 mn范围内改变，以蒸馏水为参比，测其不同波长下的吸光度值。132亚硝酸盐标准曲线的绘制。用移液管吸取0、05、10, 20、30、40、50 ml亚硝酸钠的标准使用液，分别置于50 ml容量瓶中，再加入2O ml 04对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3 min后，然后加入10 ml 02盐酸萘乙二胺溶液，加水至50 111l，混匀配置成亚硝酸钠浓度分别为0、0054、0108、0216、0324、0432、0540彬rnl，静置15 min后，以不添加亚硝酸钠的空白液为参比，于最大吸收波长处分别测其吸光度。以浓度c为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制标准工作曲线，并通过Excel软件计算回归方程。14样品的预处理141样品预处理。称取50 g经搅碎混匀的样品，置于小烧杯中，加入125 ml 5饱和硼砂溶液，搅拌均匀，用70左右的水约200 ml将样品全部加入500 ml容量瓶中，置沸水中加热15 min。取出后冷却至室温，然后边转动边加入亚铁氰化钾溶液50 fI】l摇匀，再加入乙酸锌溶液50 Inl以沉淀蛋白质，加水至500 ml，摇匀放置05 h，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液30 flll。滤液作分析测定用。142焖煮样品预处理。称取5 g搅碎的样品于小烧杯中，加水淹没，放于电炉上煮沸5 min左右，步骤同“141”样品的预处理。143炒制样品预处理。称取5 g样品于蒸发皿中，炒5rain左右，捣碎后置于小烧杯中，其余步骤同“141”样品的预处理。15肉制品中亚硝酸盐的测定准确量取样品溶液10 ml于50 ml容量瓶中，再加入20 rnl 04对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5 min后，再加入10 ml 02盐酸萘7-胺溶液。一蒸馏水定容，静置15 min后，再以蒸馏水为参比在其最大吸收波长处测其吸光度。根据标准曲线回归方程，计算肉制品中亚硝酸盐的含量。2结果与分析21亚硝酸盐标准曲线的绘制211最大吸收波长的测定。配制3种不同浓度(C。、c2、C，)的亚硝酸钠溶液，在470560 am波段范围内，分别测定其吸收值。以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制其吸收光谱曲线(图1)。结果表明，每一种浓度均在538 rim处有最大吸收值，分别为0166、0243、0304。从而确定在此系统下，利用分光光度计测定亚硝酸钠，其最大吸收波长为538nm。212标准曲线的绘制。利用亚硝酸钠标准溶液准确配置浓度分别为O、O054、0108、0216、0324、0432、0540Jeml的工作溶液，在538 nm条件下测定每种工作溶液的吸收值，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。其线性回归方程为A=0451 8Co006 9，相关系数为r=0999 7(n=5)，呈现良好的线性关系。22样品中亚硝酸盐的测定样品进行处理后，对炒制和焖煮的香肠进行亚硝酸盐的含量测定，与未处理的香肠进行对比，结果，处理后的样品中亚硝酸盐的含量均有所降低，特别是火腿肠(样品1)中亚硝酸盐的含量变化明显，由原来的807 mgkg降低为炒制的527 mgkg。通过数据对比发现：香肠类肉制品在焖煮或炒制后，亚硝酸盐(以NaNO2：含量计算