伪狂犬病活疫苗.doc

学习资料收集于网络，仅供参考 伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程编制人： 年 月 日审核人： 年 月 日 批准人： 年 月 日目 录一、目 的：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程的方法和程序。二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程三、依 据：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程四、责 任 者：生产车间、质管部。五、正 文：工艺流程及质量控制要点 操作细则1、制苗材料的制备2、生产用种毒的制备3、半成品的配制4、配苗5、疫苗的分装6、疫苗的冻干7、轧盖贴标8、包装 成品检验 工艺卫生与人员卫生 生产设备一览表 包装机检查方法 物料平衡 劳动定员及劳动保护吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件题 目伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程 编 码：SOP-SC- -共 13 页制 定审 核批 准制定日期审核日期批准日期颁发部门办公室颁发数量生效日期分发单位办公室、生产技术部、质管部一、目 的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的方法和程序。二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程三、依 据：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程四、责 任 者：生产车间、质管部。五、正 文：【品 名】伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）【质量标准】本企业伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量标准【外 观】本品为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。【规 格】10头份/瓶、20头份/瓶、70头份/瓶【储 藏】在-15以下，有效期暂定为18个月【作用与用途】用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征。免疫期为4个月。 【用法与用量】1 按瓶签注明的头份加生理盐水稀释，耳根后部肌肉注射。2 仔猪断奶前免疫1次，1头份/头。3 母猪配种前免疫1次，1头份/头。【成品代码】C【批 量】40000瓶I 工艺流程及质量控制要点种 毒 制 备鸡胚成纤维细胞制及检验备接 种旋 转 培 养收 获 半成品检验合 格不 合 格配 苗无害化处理轧盖贴标包装入 待 检 库成 品 检 验不合格入报废品库销 售无 害 化 处 理合格入成品库分 装冻 干伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量控制要点工 序质量控制要点质量控制项目频次毒种制备种 毒无菌检验每批病毒含量每批细胞制备消 化时间、温度每批细 胞外源病毒检验每批毒液制备接 种接 种 量每批观 察细胞再生状况每批半成品检验无菌检验每批病毒含量每批配 苗半成品、保护剂无菌检验每批配苗比例每批分 装分装过程无菌检验分装过程中前、中、后检验分 装 量间隔半小时标定分装量冻 干冻干曲线共融点、真空度每批成品检验成 品理化指标每 批无菌检验每 批鉴别检验每 批效力检验每 批安全检验每 批外源病毒检验每 批支原体检验每 批II 操作细则本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收获感染病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。1 制苗材料的制备1.1 条件准备1.1.1 根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。1.1.2 按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。1.1.3 在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。（ 三拼音节、 整体认读音节 ）1.2 操作规则一轮月牙 一弯月牙 一块面包 一颗星星 一个影子1.2.1 细胞的制备重轻 圆扁 东西 生死 胖瘦 头尾 宽窄 美丑 进出 臭香1.2.1.1 制苗用细胞的来源发育良好的910日龄SPF鸡胚。远近 去来 黑白 高低（矮）大小1.2.1.2 细胞制备选择910日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉克氏液洗涤23次，然后加0.25%胰酶溶液（每胚4ml），37.538.5消化2030分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏液洗涤23次再加入适量的营养液（用含5%10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素适量）吹打，用46层纱布过滤，制成每1ml含活细胞数约100150万的细胞悬液，分装于培养瓶中进行培养，形成单层后备用。彳双人旁 (徐 往） 目 目字旁（眼 睛 盯） 细胞培养物应无细菌、霉菌（见无菌（纯粹）检验标准操作规程）和支原体（见支原体检验标准操作规程）污染，无特异性病变。 将细胞冻融液接种Marc-145细胞，应不出现任何病变（见外源病毒检测标准操作规程）。一面红旗 一个朋友 一对朋友 一条木船 一条小河1.3 清场和记录小树渐渐长高了。1.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 （ 平翘舌、 前后鼻、 二三声调 ）1.3.2 全面填写生产工序记录。2 生产用毒种的制备2.1 条件准备9、区分以下形近字或音近字： 2.1.1 根据毒种制备所需物料及设备条件，进行全面准备。立刀旁：到、刚 2.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 2.1.3 在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 2.2 操作规则 2.2.1 制苗用病毒液的制备2.2.2.1 细胞单层培养 将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速912转/小时。2.2.1.2 接种 取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，弃去生长液，按2（V/V）接种病毒，加入含2%胎牛血清的细胞培养液，37C旋转（912转/小时）培养。2.2.1.3收获 在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变（CPE），直至CPE达到70%以上收获细胞培养物，反复冻融1次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40C以下。2.2.2 毒种鉴定2.2.2.1 弱毒标准2.2.2.2病毒含量 将毒种用无血清培养基做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别接种于96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1mL，设置正常的细胞对找孔，放置5%CO2，37下培养观察35日，根据Reed-Muench法计算TCID50。病毒含量应107.0TCID50。2.2.2.3 鉴别检验中和试验：将毒种用无血清培养基稀释成103TCID50/mL，取0.1mL与等量呼吸综合征病毒特异性阳性血清混合，同时设病毒对照组和正常细胞对照组，37作用1小时后，接种Marc-145细胞培养板，观察5日。应不产生细胞病变（CPE）。1.2.2.2 病毒基因鉴定 应用下列引物进行RT-PCR检测，毒种可扩增出581bp的特异性条带，以而猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1-R株为代表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及其他猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸为阴性（猪繁殖与呼吸综合征病毒 JXA1-R株RT-PCR检测方法见附注3）。U1 ATTTGAATGTTCGCACGGTCTCD2 CGGAACCATCAAGCACAACTCT2.2.2.4 毒力对仔猪的毒力 用JXA1-R-R株毒种（106.0TCID50/mL）接种46周龄抗原猪繁殖与呼吸综合征病毒、抗体阴性仔猪（阴性猪标准见附注1）5头，每头颈部肌肉注射2mL，同时设5头阴性猪作对照，隔离饲养。接种猪逐日测量体温，观察临床症状，均不发病（发病猪判定标准见附注2）。对妊娠母猪的毒力 用JXA1-R-R株毒种（106.0TCID50/mL）接种怀孕8090天的母猪3头，每头颈部肌肉注射2mL，同时设同期怀孕母猪3头做对照，隔离饲养，观察母猪临床症状和分娩产仔状况。怀孕母猪应不发生流产，所产仔猪的存活率与未接种对照组无统计学差异。2.2.2.5 免疫原性 取46周龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、抗体阴性猪（阴性猪标准见附注1）10头，其中5头肌肉注射JXA1-R-R株毒种2mL（105.0TCID50/mL），另5头作为对照，同条件下隔离饲养。28日后，所有猪肌肉注射检验用强毒NVDC -JXA1株病毒培养液（病毒含量104.5TCID50/mL）3mL，每天测温并观察21日。对照猪均应发病，且至少2头死亡，免疫猪应至少4头保护（发病猪判定标准见附注）。2.2.2.6 纯净 按现行中国兽药典进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。2.2.3 基础种子代数8290代。2.2.4 种毒保存 -70下，保存期暂定为12个月。2.2.5 强毒标准2.2.5.1 病毒含量 将毒种用无血清培养基做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，分别接种于96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1mL，在37下培养观察57日，根据Reed-Muench法计算TCID50。病毒含量应105.5TCID50/mL。2.2.5.2 对猪的毒力 取810周龄的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体阴性猪（阴性猪标准见附注1）5头，每头猪肌肉注射检验用强毒NVDC-JXA1-R（104.55.0TCID50/mL）3mL，每天测温并观察21日。猪均应发病，且至少2头死亡。1.3.3 毒种代次 56代。2.2.6 毒种保存 在-70以下，保存期暂定为12个月。3 细胞系病毒培养用细胞为Marc-145，由中国动物疫病预防控制中心鉴定、保管和供应。3.1 细胞标准3.1.1 细胞形态 用含8犊牛血清的DMEM细胞培养液，37、5CO2培养2h即可贴壁，24h内可长成单层。显微镜下，细胞呈三角形、多角形、圆形等多种形态。3.1.2 外源病毒检验3.1.2.1致细胞病变病毒检验 取2个细胞单层，每个单层至少6cm2，培养7天，每日观察细胞，应无细胞病变。3.1.2.2血吸附病毒检验 按现行中国兽药典进行检验，应无红细胞吸附现象。3.1.2.3 其它特定病毒的检验 采用PCR或RT-PCR方法检测，应无BVDV、PCV、CSFV、PPV、PRV和JEV污染。3.1.3胞核学检查 对不同传代水平的细胞，取50个处于有丝分裂中期的细胞进行检查。在基础细胞库细胞中存在的染色体标志，在最高代次细胞中也应存在。与基础细胞库的细胞相比，所有细胞的染色体模式数不得高出15%。核型必须相同。3.1.4致瘤性检验 用无胸腺小鼠至少10只，各皮下或肌肉注射107个待检细胞，同时用Hela细胞皮下或肌肉注射无胸腺小鼠，每只106个细胞，作为阳性对照，用鸡胚成纤维细胞作为阴性对照。观察21日，Marc-145细胞应无肿瘤形成，阳性对照组应出现明显的肿瘤，阴性对照组应为阴性。3.1.5 无菌检验 按现行中国兽药典进行检验，应无菌生长。3.1.6支原体检验 按现行中国兽药典进行检验，应无支原体生长。3.2 细胞代次 基础细胞应为110代，工作细胞代次应为1025代，生产用细胞应在40代以内。3.3 保存 液氮保存。保存期36个月。4 疫苗制造及半成品检验4.1 生产用毒种制备4.1.1 毒种繁殖 将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，换以含2毒种的细胞维持液，置37下培养23天，当70以上细胞出现病变时收获，置-40冻融1次，离心后分装，然后进行鉴定。4.1.2 毒种鉴定 按1.2.1、1.2.2、1.2.5项进行，应符合规定。符合上述标准的毒种作为生产用毒种。4.1.3 毒种保存 在-70下保存，应不超过12个月。4.1.4 毒种继代 应不超过3代。4.2 清场和记录4.2.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。4.2.2 全面填写生产记录。5 半成品的制备5.1 条件准备5.1.1 根据毒液繁殖所需物料及设备条件，进行全面准备。5.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。5.1.3 在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。5.2 操作规则5.2.1 接种 取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，弃去生长液，按2（V/V）接种病毒，加入含2%胎牛血清的细胞培养液，37C旋转（912转/小时）培养。5.2.2 收获 在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变（CPE），直至CPE达到70%以上收获细胞培养物，反复冻融1次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40C以下。5.3 半成品检验5.3.1 病毒含量 取病毒液按1.2.1项进行检验，病毒含量应107.0TCID50/mL。5.3.2 无菌检验 按现行中国兽药典进行检验，应无菌生长。5.4 清场和记录5.4.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。5.4.2 全面填写生产记录。6 配苗6.1 条件准备6.1.1 根据配苗所需物料及设备条件，进行全面准备。6.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。6.1.3 在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。6.1.4 将检验合格的半成品于配苗前取出，融化待用。6.2 操作规则6.2.1 配制 将经检验合格的病毒液按比例添加蔗糖脱脂乳冻干保护剂，充分混合均匀。6.3 清场和记录6.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。6.3.2 全面填写生产记录。7 疫苗的分装 操作内容见分装岗位标准操作规程。8 疫苗的冻干 操作内容见冻干标准操作规程。7 轧盖、贴标 操作内容见轧盖标准操作规程、贴标标准操作规程。8 包装 操作内容见包装标准操作规程III 成品检验见伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程、工艺卫生与人员卫生1 定期对洁净室进行消毒，并根据沉降菌测定结果决定消毒周期。2 操作间的卫生按各自区域的清洁消毒规程进行。3 生产设备按各自清洁规程进行清洁消毒。4 原辅料进入生产区按规定程序进行清洁消毒。5 人员进入洁净区时，必须按规定进行人净。进入洁净区程序：更鞋脱外衣穿普通工作服更鞋脱普通工作服洗手穿洁净服手消毒进入十万级洁净区更鞋手消毒套洁净服手消毒进入万级洁净区。6 人员在生产区内按区域个人卫生要求进行管理。7 一般区工作服每三天清洗一次，十万级区工作服每天清洗一次，万级区工作服每班清洗一次，万级洁净区使用的工作服在清洗后进行灭菌，活毒操作区的工作服须经灭菌后才能进行清洗。8 洁净室温度控制在1826，相对湿度控制在30-65%。洁净区与非洁净区的静压差应10帕。不同级别的相邻洁净区