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举例说明黄酮的提取分离方法组长：崔宁组员：翟雪 王璐璐 冯子涵 赵子惠 罗春雨 刘红成1. 提取方法1.1热水提取法热水提取法一般仅限于提取苷类. 在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素. 此工艺成本低、安全,适合于工业化大生产。以水做溶剂,同时提高浸提温度、延长浸提时间和增加液料比(60倍) ,可以明显提高芦丁的产率。实例桑叶：采用热水提取法测定桑叶中各有效成分含量，发现黄酮类化合物含量为1%以上,其中霜后桑叶黄酮类化合物含量最高为1.54% ,其次是晚秋桑叶,春季桑芽和后期桑叶含量最低。甘草：过去甘草黄酮的提取主要为水提法,其主要原理通过甘草粉与水按一定配比,加热混合至8095 浸提甘草粉,利用甘草黄酮的水溶性进而提取甘草黄酮。此法虽然要求设备简单,但因提取杂质多、提取时间长、提取液存放易腐败变质、后续过滤操作困难、收率较低等缺点,现已不常使用。1.2有机溶剂萃取法其原理是利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同,选用不同的溶剂萃取。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等,一般采取乙醇为提取溶剂。高浓度的乙醇(如90 %95 %) 适于提取苷元,浓度60 %左右的乙醇适于提取苷类。提取次数一般为24 次,提取方法有热回流提取和冷浸提取两种方式。实例桑叶：使用乙醇提取桑叶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇的浓度为70%，料液比为1:15，在80的条件下浸泡3h。使用多种有机溶剂提取发现桑叶中黄酮类化合物的最佳提取溶剂是60%丙酮。西芹：使用无水乙醇为提取剂，按西芹鲜重与提取剂的比例(W/ V) 12 ,在80 下回流提取24h ,制备西芹总黄酮。银杏叶：从银杏叶中提取总黄酮时, 随乙醇浓度的增加总黄酮提取率逐渐上升, 当乙醇浓度增至70% 时提取率最高, 之后反而下降, 故选用70% 的乙醇作浸提剂最佳。生姜：生姜黄酮提取用40倍原料的90%甲醇溶液, 在60 65 条件下提取4 h 为其优化组合, 而其试验组合中以用40倍原料的75%甲醇溶液,在60 65 条件下提取2 h的提取效果最好。1.3碱性水或碱性稀醇提取法黄酮类化合物大多具有酚羟基, 易溶于碱水, 酸化后又可沉淀析出。其原因一是由于黄酮酚羟基的酸性, 二是由于黄酮母核在碱性条件下开环, 形成2-羟基查耳酮, 极性增大而溶解。因此可用碱性水( 碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液) 或碱性稀醇( 50 %乙醇) 浸出, 浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。实例菊花：各取5g干菊花4份, ，在80恒温水浴分别以pH为8,9,10,11的NaOH溶液分两次温浸1h和0.5h。pH降低时.由于提取不完全.含量较低；pH为11时,虽然黄酮含量较高，但含有的NaOH溶质较多，而造成分析结果出现干扰，因此pH-=10时的提取效果最好。槐米：槐米粉碎, 加入5倍量的水, 用石灰水调pH 值8 9, 加入3% 的硼砂, 抽滤, 反复提取3次。滤液用稀盐酸调pH 值2 3, 静置6 h, 析出沉淀, 过滤, 滤渣干燥, 即得粗芦丁, 精制可得精制芦丁, 纯度可达99% 以上。1.4 微波萃取法微波萃取技术是物料吸收微波能后通过偶极子旋转和离子传导两种方式同时加热,加剧了体系中分子的碰撞频率,使黄酮分子容易从药材内部扩散到萃取溶剂中,大大缩短了加热时间,提高了萃取效率,尤其适合极性分子的萃取。原理是利用不同组分吸收微波能力的差异, 使基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热, 从而使得被萃取物质从基体或体系中分离, 进入到介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取剂中, 并达到较高的产率。实例桑叶：微波萃取黄酮类成分的最佳工艺条件为: 70%乙醇12倍量,于60萃取20 min,其中提取溶剂对结果有显著影响。应用微波萃取法比传统醇提法分别高55%和32%。微波萃取法在提取时间、溶剂用量及得率等方面明显优于传统的醇提法,适于工业生产。芦篙叶：用芦篙叶为原料提取黄酮类化合物。通过正交试验, 得出最优化提取条件为: 功率200W,时间10min, 料液比1g:25ml,pH 值10。提取次数为2次。在此条件下, 黄酮类化合物得率为2. 53%。并且, 随着料液比的增大, 提取率增大。但到一定程度时, 得率有所降低。可能是大量溶剂水吸收了微波导致提取温度降低的缘故。藜蒿：利用微波辅助从藜蒿中提取黄酮类化合物的方法以75% 乙醇作为提取溶剂, 密封条件下, 功率200W, 料液比1g:25ml辐射时间20 s/次x3次, 提取率最高。1.5 超声波提取法超声波提取是利用超声波空化作用加速植物有效成分浸出的提取。其基本原理是利用超声波的空化作用,破坏植物的细胞,使溶剂易于渗入细胞内,同时超声波的强烈振动能给植物和溶剂传递巨大的能量,使它们做高速的运动,加速细胞内物质的释放和溶解以及有效成分的浸出,大大提高了提取效率.实例桑叶：从桑叶中提取总黄酮，实验显示超声波提取法能够提高醇浸提黄酮含量,其值约等于常规醇提含量的2倍左右,达到省时、高效的目的。进行三水平三因素的正交试验结果表明,温度40 ,时间35min ,料液比1/ 30 ,乙醇浓度60 %及回流lh为最佳提取工艺。菊花：菊花用水浸泡，超声波提取，抽滤，将滤液定容，测定光密度值，然后查标准曲线计算总黄酮类物质的含量.超声波法正交实验结果表明,菊花中提取黄酮类化合物的最佳条件为60%乙醇浸泡24h，物料比为1:20，超声波时间为45min，总黄酮类物质的提取量为7.86%.甘草：利用超声波法从甘草中提取黄酮,通过对超声功率、超声时间、提取温度及固液比等因素的研究发现最佳提取条件为超声功率1 000 W,超声时间75 (25 ,25 ,25)min ,提取温度40 ,固液比18 ;最佳提取条件下黄酮含量为3. 612 %。1.6 超临界流体提取法超临界流体提取技术系指以超临界流体为萃取剂,从液体或固体中萃取有效成分并进行分离的方法。可作为SF的物质很多,其中,二氧化碳是首选的超临界流体。随着国际上超临界流体提取技术迅速发展,用该技术提取植物中的活性成分愈加广泛。实例金银花：采用超临界CO2 萃取技术萃取金银花中总黄酮，考察压力、温度、时间和夹带剂对总黄酮提取率的影响, 并同热醇浸泡提取法、微波提取法和超声提取法的得率进行比较; 得到超临界CO2 萃取最佳条件为: 压力30Mpa、温度40、时间120min 和夹带剂用量4.5ml/ g 时, 提取得率最高。同热醇浸泡提取法、微波提取法和超声提取法相比,其总黄酮得率分别为8.92%、9.56%、9.32%、和10.24%; 超临界CO2 提取方法同其他方法相比, 得率高、时间短, 是一种合适的提取金银花中总黄酮的方法。甘草：超临界CO2 萃取法对甘草粗黄酮提取率比常规溶制法高2. 2倍。采用超临界萃取法从银杏叶中提取黄酮类化合物, 实验表明, 超临界CO2 法可有效提取银杏叶中的黄酮类化合物, 其中黄酮含量达28%以上, 高于欧洲EGb761质量标准( 24% ); 且黄酮得率、回收率都较高(分别 4%和 64% ), 产品中无有害物质残留, 银杏叶中的有毒物质银杏酚酸的含量得到较好控制(35x10-6).茵陈蒿:与溶剂提取法相比超临界二氧化碳萃取法具有操作简单、提取率高、后续分离易于进行、品质较高等特点。100 g原料, 当pH值为9 10的70%乙醇做夹带剂, 用量600m l、萃取压力30MPa、萃取温度55, CO2 流量20 L /h、萃取时间150 m in时, 茵陈蒿总黄酮的提取率最高, 为3. 875%。1.7 双水相萃取分离法双水相萃取技术( ATPE) 分离原理是物质在双水相体系中的选择性分配，它是利用待分离物质在两相间具有分配系数，通过温度诱导相分离实现分离目的。由于天然植物中所含的化合物众多, 而双水相萃取技术具有较高的选择性和专一性,因此利用这些技术有希望为从天然植物中提取有效药用成分开辟一条新的思路.实例黄芩（qin）:利用双水相体系分离纯化黄芩苷，通过实验选择非离子表面活性剂聚乙二醇(PEG)-K2HPO3 -H2O双水相体系的成相条件及温度，pH值，聚合物的分子量等因素对黄芩苷得率的影响。结果发现黄芩苷在最佳分离条件下的萃取率为98.6。证明按本文方法所形成双水相体系，操作简便，萃取率高，方法重现性好，可适用工业化生产。葛根素: 采用聚乙二醇(PEG)/(NH4)2SO4双水相体系时,最大的分配系数可达148.2,最大收率99.09%。采用丙酮/K2HPO4双水相体系时,最大的分配系数可达36.7143,最大收率99.55%,葛根素大部分被分配在丙酮相(上相)中。研究葛根素在乙醇/硫酸铵两水相体系中的分配特性及其影响因素,在其最佳萃取条件时,最大的分配系数可达16.30,回收率94.33%,葛根素分配在上相。1.8 大孔吸附树脂提取法吸附树脂是近10 年来发展起来的一类有机分子聚合物吸附剂,其具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和,使用周期长、宜于构成闭路循环,节省费用等优点,现已广泛用于黄酮类物质的提取。实例银杏叶：应用D101 吸附树脂精制制得含黄酮约38%的GBE 产品。也有用ZTC 澄清剂沉降, 在酸性条件下吸附, 制得GBE 成品的黄酮含量稳定在26% 以上, 内酯稳定在6% 以上。比较研究表明, AB - 8树脂对银杏叶黄酮是一种优良的吸附剂, 国内首次报道了D101和聚酰胺树脂( 1B 1)混合使用纯化银杏叶黄酮醇苷,制得黄酮醇苷纯度大于24%的银杏叶提取物。金菊双花：筛选金菊双花总黄酮的最佳提取与纯化工艺。结果最佳提取工艺为8倍量55% 乙醇、100%水浴、每次1 h回流提取2 次, 再结合D101大孔吸附树脂纯化, 水、30% 乙醇、70% 乙醇梯度洗脱, 收集70%乙醇洗脱部分浓缩干燥, 测定黄酮含量为62. 7% 。枇杷叶：枇杷叶煎煮液经大孔树脂吸附, 用70% 乙醇洗脱, 洗脱液浓缩后用乙醇溶解, 沉淀去杂后减压浓缩, 经真空干燥, 得到黄色粉末, 其黄酮含量43% 以上。1.9 超滤法提取本法是以超滤膜两侧的压力差为驱动力, 凡含有两种或两种以上溶质的溶液, 通过滤膜分离流动时,其中分子体积小的溶质,经滤膜流出,而分子体积较大的溶质,不能通过滤膜而被截留.它可以有效的阤去提取液中蛋白质、多糖、高分子单宁以及部分原花色素等杂质。它的特点是在嘸温下进行、除杂效率高、分析过程中无相变、有效成分理化性能稳定,结果重复性好,准确性高, 超滤装置可反复使用，但同时对超膜的要求也相当高。实例洋葱皮：取洋葱皮粉末1g，按料液比l40加入体积分数为60%的乙醇溶液，在超声功率180W、提取温度50的提取条件下超声10min，抽滤，滤渣在相同条件下再次提取，合并滤液并过双层滤纸后制的黄酮类化合物提取液。工艺流程：黄酮提取液离心抽滤超滤真空冷冻干燥洋葱皮黄酮产品。得出结论：采用截留分子质量30000的超滤膜对黄酮提取液进行纯化，产品黄酮质量分数达到32.78%，黄酮迁移率达到91.73%。确定了截留分子质量30000膜的最佳超滤工艺：操作压力为0.2MPa，料液浓度为0.50mg/mL，超滤温度为30。1.10酶解法 酶解法对于一些黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的原料比较实用。其原理是用相应的酶充分破坏以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶,使植物中的果胶完全分解成小分子物质,减少提取的传质阻力,使植物中的黄酮类物质能充分释放出来。实例甘草：利用纤维素酶、果胶酶处理甘草提取甘草黄酮,研究发现复合酶法提取的最佳条件:以纤维素酶、果胶酶组成的复合酶,在40 ,pH 5. 0 的条件下酶解3 h ,提取率可达1. 66 % ,与微波法提取率相当。酶法提取与微波法提取相比,提取成本低,耗能低,为提取甘草黄酮提供了一种新方法。芹菜：准确称取一定量芹菜干粉，放入三角瓶中，加蒸馏水混匀，设定酶解条件（不同酶类、加酶量、值、温度、时间、固液比），进行酶解提取，抽滤，得提取液，通过观察不同的酶对芹菜黄酮得率的影响，采用果胶酶、果胶酶与纤维素酶复合酶进行酶法浸提，芹菜黄酮的得率没有明显的提高；而采用单一的纤维素酶，芹菜总黄酮得率大大提高。正交试验结果得出，酶法提取芹菜黄酮的最佳工艺条件为：采用纤维素酶，酶浓度为，温度为55，为4.5，酶解时间为2.0h.2.分离方法2.1聚酰胺柱层析法聚酰胺柱层析法分离效果好, 样品容量大, 适于在制备分离工艺中应用。但洗脱速度慢, 死吸附较大( 损失有时高达30 %) , 常有低分子量酰胺的低聚物杂质混入, 装柱时用5 %甲醇或10 %盐酸预洗除去低聚物。实例1. 以甲醇- 氯仿为洗脱剂, 用聚酰胺层析柱对各种黄酮甙类进行分离, 效果好。2. 利用硅胶层析柱( 氯仿- 甲醇作洗脱剂) 和聚酰胺层析柱( 水- 甲醇作洗脱剂)配合分离, 从黄芩中分离出11 种黄酮类化合物。3. 利用聚酰胺层析柱, 水和乙醇梯度洗脱, 从金钱草中分离到5 种黄酮类化合物。2.2 硅胶柱层析法此法应用范围最广, 非极性与极性化合物都能用, 适用于分离黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类、二氢黄酮类、异黄酮类、黄酮苷元类. 少数情况下, 在加水活化后也可以用于分离极性较大的化合物, 如羟基黄酮醇类及其苷类等. 与硅胶混存的微量金属离子, 应预先用浓盐酸处理, 以免干扰分离效果。实例1 硅胶主要用于分离极性较低的黄酮类化合物如异黄酮、黄烷类、二氢黄酮( 醇) 和高度甲基化或乙酰化的黄酮和黄酮醇。如用乙醚- 氯仿溶剂系统从野靛（dian）中分离异黄酮类。2. 硅胶柱层析法分离大豆异黄酮苷元 经丙酮萃取后，大豆异黄酮苷及其苷元约占总量的20%左右，染料木素约占其中的14.71%、黄豆黄素3.73%、大豆素为11.58%；经硅胶柱二氯甲烷和乙酸乙酯的梯度洗脱，可以分离得到3种大豆异黄酮苷元异构体；经HPLC检测，3者的纯度均超过90%故用硅胶柱层析法可以成功地分离出染料木素黄豆黄素和大豆素3个大豆异黄酮苷元单体。2.3葡聚糖凝胶柱层析法葡聚糖凝胶( 主要有SephadexLH-20 型和Sephadex-G型) 是一种淋洗速度快、可以反复使用、没有损失的非常好的分离和纯化黄酮类化合物的填充材料。其中SephadexLH-20 的洗出液中不含杂质,适用于从纸色谱分析、硅胶及聚酰胺柱色谱中分离出来的黄酮类化合物糖甙配基及糖甙的最终纯化。葡聚糖凝胶在分离游离黄酮时,主要靠吸附作用,吸附程度取决于游离酚羟基的数目,游离酚羟基的数目越多越难以洗脱;在分离黄酮甙时,则分子筛的属性起主导作用,相对分子质量的大小或含糖的多少决定化合物被洗脱。实例1. 如用甲醇作洗脱剂, 从SephadexLH-20 柱洗出下列物质先后顺序为: 刺槐甙( 山萘酚-3-半鼠李糖-7-鼠李糖甙) 、芦丁( 双糖) 、槲（hu）皮甙( 单糖) 、芹菜素( 5, 7, 4-三羟基黄酮) 、山萘酚( 3, 5, 7, 4-四羟基黄酮) 、槲皮素( 3, 5, 7, 3,4-五羟基黄酮).2. 对大豆异黄酮主要单体进行分离采用LH220 葡聚糖凝胶柱,用90 %甲醇作洗脱剂,可得到含量高达95 %以上的大豆苷和染料木甘。2.4吸附树脂分离法大孔吸附树脂具有吸附快、吸附容量大、吸附选择性好、解吸条件温和、洗脱率高、物化稳定性高、不受无机物存在的影响、再生简单、使用周期长、易于构成闭路循环、节省费用等优点, 适宜工业化生产。实例1.弱极性AB-8 大孔树脂对葛根黄酮、银杏叶黄酮进行吸附分离, 提取物中黄酮含量提高近1 倍。用D101 型树脂成功地纯化了银杏叶中的黄酮类化合物, 效果良好。2.5 膜分离纯化法膜是具有选择性分离功能的材料,利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化、浓缩的过程称作膜分离。它与传统过滤的不同在于,膜可以在分子范围内进行分离,并且这过程是一种物理过程,不需发生相的变化和添加辅助剂。膜的孔径一般为微米级,依据其孔径的不同(或称为截留分子量) ,可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜等。实例膜分离技术在葛根黄酮上的应用 采用陶瓷膜超滤系统，通过超滤过滤，在水提浸提液条件下，所得滤液质量相对较低，但加水量大幅减少，葛根黄酮收率可保持在98%以上。2.6高速逆流色谱分离纯化技术高速逆流色谱分离纯化技术的原理是利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡,当其中一相作为固定相,另一相作为流动相,在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相,物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现。与其他各种色谱分离技术的根本差别在于, 高速逆流色谱分离纯化技术不采用任何固态的支撑体(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜等) ,因此完全排除了因不可逆吸附而引起的样品污染、变性、失活等,不仅使样品能够全部回收,回收的样品也能反映其本来的特性,特别适合于天然产物活性成分的分离、纯化。实例黄芩中总黄酮的提取及高速逆流色谱分离纯化 实验得出提取黄酮乙醇浓度（60%）、溶剂用量（12倍，10倍），提取时间（2h，1h），提取二次为最佳提取工艺条件。用紫外分光光度法测定样品在本溶剂体系不同比例中的分配系数。称取适量（约2mg）总黄酮粗提物置于5mL试管中，分别加入已经达到平衡的上、下相溶剂各1mL，振荡使样品充分溶解，静置平衡，分取上、下层溶液，用紫外分光光度法测定溶剂体系上、下层所含总黄酮的浓度，求得二者样品在该溶剂系统中的分配系数（K）。根据试验结果，选择氯仿-甲醇-水-醋酸（4330.1，V/V）作为分离纯化黄芩中总黄酮的高速逆流色谱分离纯化技术两相溶剂体系。2.7 pH梯度萃取黄酮类化合物中有酚羟基的取代而显酸性, 并且由于羟基的数目和位置不同, 酸性强弱也不同, 利用这一特性, 将植物提取的总黄酮溶于有机溶剂中,依次按弱碱至强碱, 从稀碱至浓碱的水溶液的顺序进行萃取, 就可以将黄酮按较强酸性至较弱酸性的顺序分别萃取出来.实例将混合物溶于有机溶剂乙醚后, 依次用5%NaHCO3、5 %Na2CO3、0.2 %NaOH、5 %NaOH 水溶液萃取, 可依次萃取出7, 4-二羟基黄酮、7-羟基黄酮或4-羟基黄酮、一般酚羟基黄酮、5-羟基黄酮。2.8高效液相色谱法自20 世纪70 年代