环境工程微生物学实验.doc

环境工程微生物实验指导实验一 光学显微镜的操作及细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态的观察一、实验目的1掌握普通光学显微镜的构造与功能，学习与掌握显微镜观察微生物的方法。2观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会绘制微生物的形态结构图。二、显微镜的基本结构和功能普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大15002000倍。(一)显微镜的构造普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。实验图-1 显微镜的结构1.机械装置显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。(1)镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 (2)镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜(装在转换器下)间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。 (3)物镜转换器 物镜转换器上可安装34个接物镜，一般是三个接物镜(低倍、高倍、油镜)。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 (4)载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 (5)推动器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面坐标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。 (6)粗动螺旋 粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。用新近出产的显微镜镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。 (7)微动螺旋 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。2.显微镜的光学系统显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大像 。 (1)反光镜 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。 (2)聚光器 聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差的校正程度很高，是明视场镜检中质量最好的聚光器，但它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜(4)大视场照明的需要。聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.81.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑(带有视场光阑的显微镜)开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。 (3)物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径(numerical apeature简写为NA)，每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：干燥系物镜 以空气为介质，如常用的40以下的物镜，数值孔径均小于1。油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90100，数值孔值大于1。根据物镜放大率的高低，可分为：低倍物镜 指16，NA值为0.040.15；中倍物镜 指625，NA值为0.15 0.40；高倍物镜 指2563，NA值为0.350.95；油浸物镜 指90100，NA值为1.251.40。根据物镜像差校正的程度来分类可分为：消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正黄色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。特种物镜 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如：带校正环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜(FL)，平场物镜(Plan)，平场复消色差物镜(Plan Apo)，超平场物镜(Splan)，超平场复消色差物镜(Splan Apo)等。 (4)目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜(Huygens eyepiece)，如要进行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜(K)、平场目镜(P)、广视场目镜(WF)。照相时选用照相目镜(NFK)。(二)光学显微镜的成像原理显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。 三、实验器材(一)显微镜、擦镜纸等(二)标本片(三)香柏油、二甲苯四、实验步骤显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。(一)观察前的准备1.显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。2.将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。3.调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。4.调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。(二)低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒(或下降载物台)，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。(三)高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升(或镜筒下降)，直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。(四)油镜观察 油浸物镜的工作距离(指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离)很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：1.先用粗调节旋钮将镜筒提升(或将载物台下降)约2cm，并将高倍镜转出。2.在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3.从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，(或镜筒下降)，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。4.从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈(带视场光阑油镜开大视场光阑)，上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降(或镜筒上升)，当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快。以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。5.观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液(2:3)或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可(注意向一个方向擦拭)。6.将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。7.有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。五、实验报告 (一)结果 分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的标本片的形态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。 (二)思考题 1.用油镜观察时应注意哪些问题?在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用?2.试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作?实验二 微生物细胞数的计数一、实验目的1明确血细胞计数板计数的原理。2掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二、实验原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。实验图-2 血球计数板构造 1 血细胞计数板 2盖玻片 3计数室用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台上各自刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如下图。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均数，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。三、实验器材酿酒酵母血细胞计数平板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。四、实验步骤(一)菌悬液制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液(为了便于计数同，使每格约含5个细胞)。(二)镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。(三)加样品：将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。(四)显微镜计数：加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小格）的菌数；如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央l个中方格的菌数（即80个小格）；如菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差；计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。1625型血细胞计数板的计算公式：2516型血细胞计数板的计算公式：(五)清洗血细胞计数板：使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、实验报告(一)实验结果各中格菌数中格中总菌数稀释倍数二室平均数菌数/ml12345第一室第二室 (二)思考题针对实验原理、步骤、现象进行讨论。根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？实验三 微生物的染色一、实验目的学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。二、染色原理 一般的微生物细胞含水量都在8090，因此细胞对光的吸收和反射与水溶液相差不大，特别在油浸镜下观察时细胞与背景几乎无反差，呈现一片透明状态。所以在观察微生物细胞的一船结构与特殊结构时都采用染色法，其目的是通过细胞对染料的吸着所产生的与背只较明显的阴暗差，使观察容易。微生物细胞染色的基本原理是根据物理因素和化学因素的作用。物理因素包括细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附、吸收作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发要的化学反应。一般酸性成分对碱性染料较易吸附，而且较稳定。同样，碱性成分对酸性染料也较易吸附，而且也较稳定。实际上，细胞内一些成分为两性物质，其性质与pH的改变密切相关。 细菌的等电点较低，大约在pH25之间。因为细菌正常带有负电荷，它们在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷。碱性染料离子带阳电荷，因此带阴电的细菌往往和带阳电的染料容易结合，所以细菌一般常用碱性染料进行染色。碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红等。微生物染色方法般分为单染色法复染色法、特殊染色法及负染色法。单染色法是用一种染料使微生物染色但不能鉴别微生物；复染色法则采用两种或两种以上的染科，将不同微生物染成不同颜色以鉴别微生物，常用的有革兰氏染色法和抗酸染色法；负染色法则使微生物背景着色；特殊染色法可将细菌各部结构染成特定颜色。三、实验器材(一)显微镜、香柏油(或液体石蜡)、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯(二)石炭酸复红(品红)染液、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液(三)菌种：枯草杆菌、大肠杆菌四、实验步骤(一)细菌的简单染色步骤1.涂片 取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(大肠杆菌或枯草杆菌)与载玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面积不宜过大。2.干燥 最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。3.固定 将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过 23次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。4.染色 在载玻片上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)，使染色液铺盖涂有细菌的部位作用约1min。5.水洗 倾去染液，斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至水呈无色为止。6.吸干 将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠(注意勿将细菌擦掉)。7.镜检 用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。(二)细菌的革兰氏染色步骤1.取大肠杆菌和枯草杆菌(无以无菌操作)分别作涂片、干燥、固定。方法与简单染色法相同。2.将固定好的涂片滴加草酸铵结晶紫染液染1min，若干了还要补加染料，用缓流水冲去染料。3.加革氏碘液浸没，起媒染作用1min，用缓流水冲去碘液并吸干。4. 慢慢滴加酒精-丙酮脱色液直到染料不再流去(注意：脱色速度与酒精浓度涂片厚度、涂片的干湿程度有关)，一般约为3060 s，再一次用缓冲流水洗去并吸干。5.用蕃红染液复染1min，用缓流水洗去。6.用吸水纸轻轻吸干，直接用显微镜观察先用低倍镜观察，然后用油浸镜观察，作图。G+紫色，为革兰氏阳性菌；G-红色，为革兰氏阴性菌。 (三)染色注意要点从革兰氏染色法可以看到染色操作包括制片、固定、染色、媒染、 脱色、复染、水洗、干燥等步骤，每一步部具有其操作要点和注意点，若不当心，可能就得不到满意的结果。在进行革兰氏染色中有时结果不稳定， 主要的原因是脱色时间掌握不当涂片太厚，或菌龄太长一般采用2024h的培养物。制片要采用干净的载玻片，并注意接种环的无菌操作。倾斜面菌体片时，要防止菌体和水混合不均匀有结团现象，注意菌体量适中。涂片后最好先在室温下自然干燥，然后固定。固定常用高温。手持载玻片一侧， 标本面朝上，在火焰外层快速来回通过34次。共约34s，要求被面温度不超过60，此时以手背皮肤接触不觉过烫为度。放置待冷后染色。五、实验报告(一)实验结果用革兰氏染色法染大肠杆菌和枯草杆菌后各得什么结果(包括颜色、细菌形态、为何种染色反应等)？(二)思考题1.为什么要求完全干燥后才能用油镜观察？2.进行革兰氏染色时，为什么强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？3.微生物经固定后是死的还是活的？实验四 培养基的制备和灭菌一、实验目的(一)熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。(二)掌握培养基和无菌水的制备方法。(三)掌握高压蒸汽灭菌技术。二、基本原理正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同。例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内冷空气从排气阀中驱尽，关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。三、 实验器材(一)药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。(二)设备：高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。(三)仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。(四)其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。四、实验步骤(一)玻璃器皿的洗涤和包装1.玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。2.灭菌前玻璃器皿的包装 (1)培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸或牛皮纸将几套培养皿包成一包。(2)移液管的包扎：在移液管的上端用细铁丝塞入一小段棉花，塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约11.5cm。 实验图-3 移液管的包扎棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧。在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 (二)液体及固体培养基的配制过程1.液体培养基配制(1)称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各成分的用量然后进行准确称量。(2)溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻璃棒搅动，加热溶解。(3)定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。(4)调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。(5)过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。2.固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.52)加入，并用玻璃棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。 (三)棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎 为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。1.试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。 实验图-4 棉塞的制备 实验图-5 正确与不正确的棉塞将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。2.三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。(四)培养基的灭菌培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行高压蒸汽灭菌。(五)斜面和平板的制作1.斜面的制作将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度l/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至凝固。2.平板的制作将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入1015mL培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。(六)培养基的灭菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出12管(瓶)，置于37温箱中培养12天，确定无菌后方可使用。(七)无菌水的制备在每个250mL的三角瓶内装100mL的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞。在每支试管内装4.5mL蒸馏水，塞上棉塞或硅胶塞。再在棉塞上包上一张牛皮纸，高压蒸汽灭菌，0.1MPa灭菌2030min。四、 实验步骤(一)根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行包扎。(二)根据要求配制各种培养基。(三)用电热鼓风干燥箱对玻璃器皿进行干热灭菌。(四)用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌。五、 实验报告(一)简述移液管和培养皿的包扎注意事项。(二)简述配制培养基的基本步骤及注意事项。(三) 为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞(硅胶塞)才能使用？(四) 配制培养基时为什么要调节pH？实验五 细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的(一)掌握倒平板的方法和几种分离、纯化微生物的基本操作技术。(二)了解不同微生物培养在斜面上和液体、半固体培养基中的特征。(三)进一步熟悉和掌握微生物的无菌操作接种技术。二、实验原理为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。微生物的培养特征是指微生物培养在培养基上所表现出的群体形态和生长情况。一般可用斜面、液体和半固体培养基来检验不同微生物的培养特征。利用这些特征，可以作为它们的种类鉴定和识别纯培养是否污染的参考。三、实验器材(一)培养皿、移液管、试管等。(二)接种针、酒精灯或煤气灯、恒温箱、灭菌锅等。(三)营养琼脂培养基、活性污泥或土壤或湖水一瓶、无菌水等。四、 实验步骤细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。(一)稀释平板涂布法1.取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的活性污泥或土壤或湖水，迅速带回实验室。 2稀释水样 先将待分离的材料(活性污泥或土壤或湖水)用无菌水(加入玻璃珠)作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1 000)。左手拿皿底，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将0.5mL的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，倒置于30培养2448h后观察结果，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。实验图-6 稀释后平板分离细菌单菌落 (二) 平板划线分离法划线在近火焰处，左手拿皿底，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀半开，右手拿接种环，以无菌操作沾取少许待分离的材料，伸入培养皿内，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。实验图-7 平板划线分离法a.扇形划线 b.连续划线 c.方格划线 d.划线分离培养后平板上显示的菌落微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。(三)斜面接种1.接种前在牛肉膏蛋白胨斜面试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径23cm处的位置。2.点燃酒精灯或煤气灯。3.将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，并将中指夹在两试管间，使斜面向上，成水平状态。在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。4.右手拿接种环，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。在火焰边用右手的手掌边缘和小指、无名指分别夹持两支试管的棉塞将其取出，并迅速烧灼试管口。5.将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，达到冷却目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划曲线，切勿划破培养基，也不要使环接触管壁或管口。6.接种环退出斜面试管，用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞上棉塞并插在试管架上。将接种环在火焰上灼烧，则接种完毕。 五、实验报告(一)实验结果在你所实验的培养基平板上长出的菌落共分离出几种？分别简述它们的菌落形态特征。(二)思考题1.为什么要将培养皿倒置培养？2.接种时，怎样才能更好地保证菌种不被污染？实验六 细菌菌落总数(CFU)的测定一、实验目的 (一)学习并掌握水样的采取方法，水体中细菌总数的检验方法、检验原理、检验依据、数据处理和报告方法。(二)了解水源水样的平板菌落计数的原则。(三)强化水体细菌总数检验的卫生学知识。二、实验原理 本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖。因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、实验器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌三角烧瓶，灭菌的带下班塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，灭菌水等。四、实验步骤(一)水样的采取1.自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角瓶接取水样，以待分析。2.池水、河水或湖水 应取距水面1015cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入海洋污染中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。(二)细菌总数测定1.自来水(1)用灭菌吸管吸取1mL水样