DHQ.Western Bloting.ppt

WesternBlot SouthernblotDNANorthernblotRNAWesternblot蛋白质EasternBlotting检测蛋白质翻译后修饰Southwesternblotting检测DNA和蛋白质互作Far westernblotting检测蛋白质之间的相互作用 SDS PAGE 转膜 免疫印迹 免疫印迹原理 转膜 转膜方法及比较 三明治 结构常用膜及比较 转膜方法 方法 湿转 半干转 小分子量的蛋白半干转效果比较好 在我们公司小分子采用的是另一套系统 主要区别是三层胶 Runningbuffer用的是Trisine Hcl缓冲液 并且用孔径更小的PSQ膜 大分子量 100KD 以上建议湿转 具体转膜条件需要根据分子量来确定 30 80KD半干转恒流1mA cm2 1 1 5h都可以 大分子湿转100V 2 5h以上湿转 Buffer一定要预冷 最好提前一天配好放4度 滤纸不要大过PVDF膜 防止短路 胶在负极 膜靠近正极 放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首 膜要标记好正反面 转膜过程中 经常过去看看 防止意外 如电泳仪接触不好 湿转 湿转是一种传统方法 将胶 膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压 这是一种有效方法但比较慢 需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液 另外用这种方法转移2 D电泳中常规使用的大胶比较困难 湿转系统一般在恒压条件下进行 转移过程中混合缓冲液保持电流相对恒定 返回 半干转 用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽 因为电极板直接与滤纸接触 使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移 与湿转相比 这种方法又快 15 45分钟 又好 多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统 可以同时高效转移大小不同的蛋白 然而 半干印迹系统因缓冲液较少不适于较长时间转移 对于大2 D胶的印迹 半干转移是理想选择 半干印迹仪一般使用恒流条件 转移过程中电压逐渐增加 半干转移系统中 滤纸和膜切成和凝胶相同大小 这样电流必须通过凝胶 否则 在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路 返回 返回 注意 防止在滤纸 凝胶和膜之间的任何地方存在气泡 气泡阻碍转移并在印迹膜上产生 秃斑 即非转移区 封闭 封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合 常用的封闭液有BSA non fatmilk casein gelatin tween 20等 我们一般用non fatmilk 甲醇封闭 免疫印迹 操作流程中的相关原理 一抗 酶标二抗 ECL底物 定影液 DAB染色 显影液 WB显色 HRP反应底物 色原底物 在酶作用下产生一种新的颜色或者吸收光谱发生改变 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB 5一氨基水杨酸 5 AS 二氨基联苯胺 DAB 邻联二茴香胺 ODA 邻联甲苯胺 OT 等 荧光底物 2 2 苯乙烯基 苯并噻唑化学发光底物 酰肼类 如鲁米诺 3 氨基苯二甲酰肼 异鲁米诺 4 氨基苯二甲酰肼 及其衍生物 咪唑类 较常用的是2 4 5 三苯基咪唑 俗称洛酚碱 吖啶盐类 最为常用的是N N 二甲基吖啶硝酸盐 俗称光泽精 草酸盐类 该类化合物本身不是有效的化学发光剂 它和H2O2反应生成过氧化物中间体 而这种中间体是一个最佳的化学发光关键性中间体 它能释放出较多的能量 此能量可转移至加入反应体系的另一种物质的分子 使这种物质的分子激发而发光 这类化学发光反应的发光效率很高 例如双 2 4 6 三氯基苯 草酸盐 TCPO ECL底物反应原理 反应底物为过氧化物 鲁米诺 5 氨基 2 3 二氢 1 4 酞嗪二酮 如遇到HRP 即发光 可使胶片曝光 就可洗出条带 返回 胶片原理 曝光时 光能作用于卤素银 AgX 晶体 卤素银中的卤离子 X 便失去一个电子而成卤原子 X 如图中的乙 其反应式如下 AgX 光 X e Ag 卤化银卤素电子银离子所产生的自由电子 形成电子流在晶体中游动 当它们遇到感光中心时 就会被该中心所吸引 使该中心带上负电荷 当遇到负电场 便向感光中心集中 被中和成银原子 就如式子 Ag e Ag银离子电子银原子当感光片的曝光量达到一定程度后 感光中心便因银的增加扩大而成显影中心 它是潜像的根据 所以生成卤元素 则被周围胶质吸收 显影液原理 感光片和感光纸 相纸和放大纸 上的卤化银在光的作用下会发生分解 生成银原子和溴原子AgBr Ag Br这时感光片 纸 上形成的是潜影 潜影只有经过显影液的处理 才能变成可视影像 显影液处理感光片 纸 是个化学过程 显影液使已感光的卤化银还原成金属银 变成黑色 感光片 纸 上感光多的部分 还原出的银粒多 感光少的部分还原出的银粒少 没有感光的部分不发生还原反应 这个过程就是显影 定影液原理 定影的作用是把感光片上未受光和未受显影液作用的卤素银溶解掉 只保留已还原的银原子 因此定影剂要求能溶解卤素银 而不破坏已还原的银 DAB染色反应原理 二氨基联苯胺 Diaminobenzidine DAB 是辣根过氧化物酶最敏感 最常用的显色底物 反应产物因不溶于水 二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于WB IHC和ICC Dotblot和Biochip等的染色和显色反应 方程式 2H2O2 HRP 2H2O O2 O2 DAB 棕褐色不溶性产物 考马斯亮蓝法原理 1976年由Bradford建立 是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的 这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一 考马斯亮蓝G 20染料 在酸性溶液中与蛋白质结合 使染料最大吸收峰位置 由465nm变为595nm 溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色 染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合 在595nm下测定的吸光度A595 与蛋白质浓度成正比 WB过程中常见的问题及可能原因分析 一 转膜不充分 二 背景高 三 没有阳性条带 四 有阳性条带 但条带比较弱 五 条带位置 大小 不对 或有非特异性条带 六 背景有斑点 七 膜上出现反像 转膜不充分 膜没有完全均匀湿透 使用100 methanol浸透膜靶蛋白分子量小于10 000 选择小孔径的膜 缩短转移时间靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液 pH10 5 或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液甲醇浓度过高 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离 从而沉淀在凝胶中 同时会使凝胶收缩或变硬 从而抑制高分子量蛋白的转移 降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替转移时间不够Thickgel 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 背景高 膜没有完全均匀湿透 使用100 methanol浸透膜洗膜不充分 增加洗液体积和洗涤次数阻断不充分 增加封闭液孵育时间 或者提高温度 选择合适的封闭试剂 脱脂奶粉 BSA 酪蛋白等 二抗浓度过高 降低二抗浓度检测过程中膜干燥 保证充分的反应液 避免出现干膜现象曝光过度 缩短曝光时间抗体与阻断蛋白有交叉反应 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性 选择无交叉反应的封闭剂 洗涤液中加入Tween 20可减少交叉反应 返回 没有阳性条带 抗体染色不充分 增加抗体浓度 延长孵育时间酶失活 直接将酶和底物进行混合 如果不显色则说明酶失活了 选择在有效期内 有活性的酶联物标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 设置阳性对照 如果阳性对照有结果 但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因 试剂不匹配 一抗与组织种属 一抗与二抗或 和底物与酶系统之间不匹配 通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性一抗失效 选择在有效期内抗体 并选择现配现用的工作HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 返回 有阳性条带 但条带比较弱 抗体染色不充分 增加抗体浓度 延长孵育时间酶活性降低 直接将酶和底物进行混合 如果不显色则说明酶失活了 选择在有效期内 有活性的酶联物标本中靶蛋白含量太低 增加标本上样量 洗膜过度 缩短洗涤时间HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠抗体活性降低 选择在有效期内的抗体 工作液现配现用 避免长时间放置蛋白转移不充分 见上述封闭过度 减少封闭剂的量或缩短时间 换用不同封闭剂类型曝光时间过短 延长曝光时间HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 返回 条带位置 大小 不对 或有非特异性条带 二抗的非特异性结合 增加一个对照 不加一抗 其他操作过程不变 即可验证背景是否由二抗系统来源 选择其他二抗 特异性更强的 只针对重链的 一抗的特异性不够 使用单克隆或者亲和纯化的抗体 保证抗体的特异性蛋白降解 使用新鲜制备的标本 并使用蛋白酶抑制剂二