冰冻切片.doc

冷冻切片一、 恒温冷冻切片将组织在恒温冷冻切片机里切片。冷冻腔内的温度一般设置为-18至-25，根据不同组织调节不同的腔温，平时应将冷冻头放置于冷冻台上。冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。(1)、 当冰冻组织取好后，有速冻开关的机器可先将开关打开，再在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基纤维素(可用普通胶水代替)，放上组织，速冻。(2)、 待组织冻结后，将冷冻头装到切片机上(3)、 粗切，修出切面细切几张，用毛笔刷去刀上组织片(4)、 放下抗卷板，开始切片，切片厚度一般为56微米，切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇中固定，固定时间为1020秒(5)、 水洗(6)、 苏木素1分钟(7)、 水洗(8)、 盐酸酒精分化1秒钟(9)、 水洗(10)、温水蓝化(11)、伊红25秒钟(12)、梯度酒精快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。冰冻切片的注意事项:(1) 速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可切片。特别适用于较脆的组织。而含有脂肪较多的组织，最好放在液氮里处理。在液氮里冷冻要注意不要冻过头，23秒钟就要拿出来看一下，只要有4/5的组织已经冻住就可以了，待冷冻头拿出后刚好全部冻住，否则就会引起组织发脆，或冷冻头与组织分离。(2)固定：切片后应立即放入甲醇中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。固定液有很多种，根据我们的实践，认为甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液。 如加5%冰醋酸较果更好。(3)包埋剂：可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例大约在2：1左右）。太稀了，容易损伤切片刀；太稠了，粘在切片上不容易洗掉,影响切片的质量。 (4)冰冻用切片刀不仅要磨的快，而且要磨的直，否则切出的片子就不会平整,不能进入抗卷板。最好能使用一次性刀片。 (5)如组织发脆，可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温；如果用手去摸组织块，最好戴手套，或用玻片间的纸夹在手与组织之间，以防感染。 (6)冷冻室的温度冬天一般设在-19左右，夏天设在-22左右。不同的组织,有不同的温度要求:肝脏、甲状腺组织温度控制在-15左右，脂肪组织一般在-35以下。(7) 冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态，经常的开关机器电源容易造成压缩机损伤。二、半导体制冷切片(1)组织放置在半导体制冷台上，加少量水，调好切片的厚度(2)接通循环流水后，再接通电源，在使用的全过程中不能中断流水，等电源关上后才能停水。并且正负极不能接反，用整流电源控制温度。冷冻组织周围的水不能过多(3)待组织发硬到可切成厚薄一致的切片时，即可切片。切片厚度56微米，切片用毛笔展平后，立即放入甲醇中固定，固定时间为1分钟(4)苏木素1分钟(5)水洗(6)盐酸酒精分化1秒钟(7)水洗(8)温水蓝化(9)伊红25秒钟(10)梯度酒精快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。三、二氧化碳冷冻切片 a)先将组织放入加热的20%甲醛溶液中固定12分钟，水洗(也可将组织不经固定直接放在切片机的冷冻台上)b)放在切片机的冷冻台上，加少量水，打开二氧化碳开关，此时有二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜后，关闭二氧化碳c)切片，切片厚度68微米，将切出的片子放于水中舒展，用镊子将组织平铺于载玻片上(如未固定组织的切片直接用载玻片粘贴，立即放入甲醇中固定2秒，然后进行染色，)d)加热烤片，烤片温度不宜超过60，更不能将组织烤焦。e)染色时将苏木素滴加在载玻片上，加热1分钟(6