分光光度计的基本原理.doc

分光光度计的基本原理 姓名：陈凯 专业：生物科学 学号：2012040216 分光光度计的基本原理分光光度计主要用于反射和透射测量。分三种光源：S偏振光、P偏振光和自然光。现有设备7台（2台日立U4100、1台JACSO-V650、1台JACSO-V570、2台KT1100、1台瞬间7700）主要由是由分光光度计和电脑组成，由电脑程序驱动。一分光光度计的组成各种型号的可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。1.光源在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源。热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。2.单色器 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。3.吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。4.检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。5.信号指示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等二.分光光度计光谱范围包括波长范围为400760 nm的可见光区和波长范围为200400 nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.氢灯（或氘灯）的发射光谱:氢灯能发出185400 nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源.物质的吸收光谱(1)如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.物质的吸收光谱(2)当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液.入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为空白去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则:入射光 = 吸收光 十 透过光三.原理及测试方法分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc式中 :A 为吸光度；基本原理I。为入射的单色光强度；I 为透射的单色光强度；T 为物质的透射率；k 为摩尔吸收系数；L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长c 为物质的浓度物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。四.分光光度计的特点应用广泛：紫外可见分光光度计应用范围很广。任何物质只要在紫外可见波段中吸收光谱，均可用紫外可见分光光度计来进行定性、定量分析；灵敏度高：由于新的显色剂的大量合成，并在应用研究方面取得了可喜的进展，使得对元素测定的灵敏度有所推进，特别是有关多元络合物和各种表面活性 C C未A未A 标准工作曲线图maxA 4 剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万；选择性好：目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法；准确度高：对于一般的分光光度法，其浓度测定的相对误差在13%范围内，如采用示差分光光度法进行测定，则误差可减少到0.X%；适用浓度范围广可从常量（1%50%）到痕量（10-810-6%）；分析成本低、操作简便、快速由于分光光度法具有以上优点，因此目前仍广泛地应用于化工、冶金、地质、医学、食品、制药等部门及环境检测系统。单在水质分析中的应用就很广，目前能有直接法和间接法测定的金属和非金属元素就有70多种。五.分光光度计的操作及注意事项测试方法1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）3.根据所需波长转动波长选择钮。4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。注意事项1该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。2使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。3在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。六.应用1.生物医药上的应用可利用分光光度计进行氨基酸含量的测定、测量未知蛋白溶液的浓度及含量、新生儿血清胆红的测定以及蛋白质与核酸的结构分析等。2印染上的应用可以测定纺织品上的甲醛含量、染料对织物的上染百分率、测定蛋白助剂在织物上的均匀程度、测定整理在织物上助剂的浓度、测吸附速率曲线、半吸附时6 间、吸附饱和值、平衡吸附量、测吸附量与K/S值的关系、吸附助剂量与其他性能的关系（如防毡缩）等。3.饲料工业中的应用用饲料添加剂中的皮蝇磷、磺胺类药物、灰黄霉素、二甲硝咪唑, 以及普鲁卡因等的测定, 基本上也都可用紫外可见分光光度计来进行检测。4.农药及其残留物分析施加的农药进入土壤中, 一部分被农作物吸收( 如六六六可被胡萝卜、花生等吸收)、一部分进入大气、一部分流入水中。农药残留包括农药原体、农药的有毒代谢物、农药的降解物和杂质。人们往往只把农药原体看成农药残留量, 忽略了农药原体的代谢物、降解物和杂质。其实, 代谢物、降解物的毒性与原药一样或更严重。例如, 滴滴涕的代谢物为滴滴依, 工业六六六的代谢物为乙体六六六, 农药1605 的代谢物为1601 , 这些代谢物的毒性都比原体更强。杀虫脒的代谢物的毒性, 比原药大10 倍。许多农药对人