「实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量」.doc

实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量姓名：mangogolaSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是：蛋白质在电泳中的迁移速率取决于其所带电荷、分子大小以及形状等因素，而大多数蛋白质与SDS按一定比例结合（1:1.4/g:g），这样使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，而且形状为短轴相同的雪茄烟形。由此蛋白质分子的电泳迁移率仅取决于其分子量，在特定凝胶浓度下，一定范围内的蛋白质分子量对数与迁移率呈直线关系，选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白，与样品同时电泳计算得到标准曲线，并根据待测样品的相对迁移率在标准曲线上查出其分子量。一实验过程浓缩胶浓度4%，交联度2.7%Acr（30%）：Bis（0.8%）溶液0.67mldd水3.05ml0.5M pH6.8 Tris-Hcl（0.4%SDS）溶液1.25mlTEMED（原液）6ul将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀，加入10%的硫代硫酸铵0.026ml，摇匀后灌胶。分离胶浓度12%，交联度2.7%Acr（30%）：Bis（0.8%）溶液4mldd水3.44ml1.5M pH8.8 Tris-Hcl（0.4%SDS）溶液2.5mlTEMED（原液）6ul将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀，加入10%的硫代硫酸铵0.056ml，摇匀后灌胶。1.凝胶工作液的配制2.灌制分离胶将制胶玻璃板清洗安装紧密后，插入制孔器，在距制孔器下端1cm处做一标记，取下制孔器将分离胶溶液加入两块玻璃板之间至标记处。然后立即用注射器向凝胶液面轻轻铺上一层厚约0.5cm的dd水，目的是使凝胶面平整，放置待其聚合凝固。3.灌制浓缩胶将分离胶上的双蒸水用注射器取出并用滤纸吸干，放入制孔器，用滴管灌入浓缩胶至玻璃板顶端待其聚合凝固。4.待测样品的制备取0.1ml透析除盐后的样品稀释液（浓度在0.2mg/ml左右），加入0.1ml样品溶解液，混匀后沸水浴5min，冷却。（沸水浴的目的是使蛋白质变性成肽链，便于与SDS结合，甘油可以增加蛋白质的比重，便于沉降到加样孔底部，不易飘散）5.加样和电泳将电极缓冲液注入缓冲液槽，然后轻轻拔出制孔器，加样后连接电泳仪，记录每个加样孔的样品类型及上样量。浓缩胶使用50V恒压，分离胶使用100V恒压。6.染色和脱色用取胶片将两张玻璃板撬开，取出凝胶，切去浓缩胶部分及染料前端至分离胶底端部分，并在剩余胶片的右上角切去一块作为标记。而后转入盛有染色液的大培养皿中，低速振荡染色1.5h，然后分别用高浓度和低浓度甲醇溶液脱色1.5h，最后用低浓度甲醇溶液脱色过夜至背景脱色。二数据记录和处理1.标准曲线绘制蛋白质Marker的相对迁移率如下表：类别分子量MM样品迁移距离（cm）染料迁移距离（cm）相对迁移率兔磷酸化酶B974004.9885590.954.30.220930牛血清白蛋白662004.8208581480.344186兔肌动蛋白430004.633469220.511628牛碳酸酐酶310004.4913622850.662791胰蛋白酶抑制剂201004.303196360.837209鸡卵清溶菌酶144004.158363420.976744标准曲线绘制如下：即标准曲线为：Mr=5.20519-1.07931*m2.计算样品分子量样品迁移率记录如下表：类别样品迁移距离（cm）染料迁移距离（cm）相对迁移率分子量天花粉蛋白3.054.30.709302327519胰蛋白酶30.697674428326人血清白蛋白1.450.337209369380牛血清白蛋白1.460.339534968981三分析与讨论1.影响蛋白质和SDS结合的因素主要有：二硫键是否被完全还原，只有在蛋白质分子内二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量结合到蛋白质分子上，并使之具有相同的构象，一般以巯基乙醇作还原剂；溶液中SDS的总量至少比蛋白质高三倍，一般需高达10倍以上；溶液中的离子强度应较低，最高不超过0.26，所以样品要经透析处理。2.在凝胶电泳中影响迁移率的因素有很多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制的完全一致。因此，用SDS凝胶电泳测分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。3.凝胶电泳所用试剂要求严格，需准确配制。4.胰蛋白酶在pH3.0下稳定，但透析后容易自容，所以上样时应尽量