DIGE原理.docx

2.1.122D-DIGE双向电泳（1）2D-DIGE实验设计为保证结果的准确性和统计分析的可靠性，不同样品采用不同的荧光染料标记，不同样品之间进行组合进行2D-DIGE分析。具体实验设计如下表：表2-2 2D-DIGE实验设计编号 染料Cy2Cy3Cy5Gel1内标GVRCGel2内标RCGRGel3内标GRGVGel4内标GVGRGel5内标RCGV（2）蛋白进行荧光标记之前，先进行2D IEF-SDS-PAGE分析，确保蛋白样品进行2D电泳分析的准确性和可靠性。100 g蛋白样品混合饱胀溶液，内含有8 M尿素、2%（m）CHAPS以及少量溴酚蓝颜色指示剂，20 mMDTT还原剂，0.5% (v)IPG缓冲液。等电聚焦总Vh达到55,000Vh为止。将等电聚焦的胶条放入还原液、平衡液分别在暗处处理15 min和10 min后进行第二向电泳。（3）蛋白荧光染料标记。50 g蛋白分别按照上表所示,使用400 pmol染料标记。含有等量样品的蛋白内标使用Cy2染料标记。蛋白标记在暗处放置30 min，以保证充分反应。通过添加1 L的10 mM赖氨酸溶液终止标记反应。（4）2D-DIGE电泳。非线性梯度的24 cm的IPG预制胶条 pH梯度范围为 3-10（GE Healthcare，瑞典）。第二向SDS-PAGE凝胶尺寸为2024 cm，丙烯酰胺浓度为12%。（5）荧光电泳凝胶图像采集。带有染料标记的二维凝胶，使用Typhoon 9410扫描仪扫描（GE Healthcare，英国）进行扫描。Cy2、Cy3、Cy5标记的样品分别使用不同的激发波长激发，检查荧光。它们对应的激发/发射光波长分别是：488/520 nm、532/580 nm和633/670 nm。2.1.132D-DIGE凝胶图像分析对激光扫描仪采集的荧光凝胶图像，使用DeCyder软件（版本号V5.02，GE Healthcare）定量分析。首先，指定内标状态最好的凝胶图像为Master凝胶，以作为蛋白点在凝胶上定位标记的模版。Master胶内蛋白点的识别和定量使用DIA模块进行自动处理完成；凝胶之间与Master胶之间的匹配使用BVA模块进行自动分析。自动匹配结束后，手动确认每个点的匹配状态。蛋白定量通过计算每个蛋白点光密度的积分值来统计。内置于VBA模块内的one-way ANOVA统计分析模型用于检验组间蛋白定量差异的显著性。蛋白相对含量差异3倍或者3倍以上，P0.05并且在每个胶图中均出现的蛋白点被认为是有效的差异蛋白点。通过制备胶，将对应的差异蛋白点取出，保存在-80 ，以进行后续蛋白鉴定。2.1.122D-DIGE双向电泳（1）2D-DIGE实验设计为保证结果的准确性和统计分析的可靠性，不同样品采用不同的荧光染料标记，不同样品之间进行组合进行2D-DIGE分析。具体实验设计如下表：表2-2 2D-DIGE实验设计编号 染料Cy2Cy3Cy5Gel1内标GVRCGel2内标RCGRGel3内标GRGVGel4内标GVGRGel5内标RCGV（2）蛋白进行荧光标记之前，先进行2D IEF-SDS-PAGE分析，确保蛋白样品进行2D电泳分析的准确性和可靠性。100 g蛋白样品混合饱胀溶液，内含有8 M尿素、2%（m/v）CHAPS以及少量溴酚蓝颜色指示剂，20 mMDTT还原剂，0.5% (v/v)IPG缓冲液。等电聚焦总Vh达到55,000Vh为止。将等电聚焦的胶条放入还原液、平衡液分别在暗处处理15 min和10 min后进行第二向电泳。（3）蛋白荧光染料标记。50 g蛋白分别按照上表所示,使用400 pmol染料标记。含有等量样品的蛋白内标使用Cy2染料标记。蛋白标记在暗处放置30 min，以保证充分反应。通过添加1 L的10 mM赖氨酸溶液终止标记反应。（4）2D-DIGE电泳。非线性梯度的24 cm的IPG预制胶条 pH梯度范围为 3-10（GE Healthcare，瑞典）。第二向SDS-PAGE凝胶尺寸为2024 cm，丙烯酰胺浓度为12%。（5）荧光电泳凝胶图像采集。带有染料标记的二维凝胶，使用Typhoon 9410扫描仪扫描（GE Healthcare，英国）进行扫描。Cy2、Cy3、Cy5标记的样品分别使用不同的激发波长激发，检查荧光。它们对应的激发/发射光波长分别是：488/520 nm、532/580 nm和633/670 nm。2.1.132D-DIGE凝胶图像分析对激光扫描仪采集的荧光凝胶图像，使用DeCyder软件（版本号V5.02，GE Healthcare）定量分析。首先，指定内标状态最好的凝胶图像为Master凝胶，以作为蛋白点在凝胶上定位标记的模版。Master胶内蛋白点的识别和定量使用DIA模块进行自动处理完成；凝胶之间与Master胶之间的匹配使用BVA模块进行自动分析。自动匹配结束后，手动确认每个点的匹配状态。蛋白定量通过计算每个蛋白点光密度的积分值来统计。内置于VBA模块内的one-way ANOV