染色质分析工具的使用方法.doc

染色质分析工具的使用方法常染色质是转录活跃的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染，易被核酸酶在一些敏感的位点降解。与常染色质相比，异染色质是转录不活跃的部分，染色深，核酸酶无法接近，也就不能降解DNA。因此，利用核酸酶消化和qPCR，通过Cq改变就能评估染色质状态。表观遗传学过程，如DNA甲基化和组蛋白修饰，通过改变染色质结构来控制基因表达。转录活跃的基因与“开放”或“可接近”的染色质区域相关，而转录沉默的基因通常与“关闭”或“难接近”的染色质区域相关。Bio-Rad公司推出的EpiQ染色质分析试剂盒（EpiQ chromatin analysis kit ）就是利用上面的原理来定量评估染色质结构。通过原位染色质消化、基因组DNA纯化以及实时定量PCR，您可以同时研究几个基因启动子的染色质状态。作为一款新颖的表观遗传学研究工具，EpiQ试剂盒可协助确定表观遗传学事件（如DNA甲基化和组蛋白修饰）对基因表达调控的影响。目前定量确定染色质结构状态的方法较为复杂，且耗时长。它需要从细胞中分离出细胞核，并进行染色质消化，通常需要两天以上才能完成。有了EpiQ试剂盒，无需分离细胞核，6小时即可获得染色质结构的数据。此外，该试剂盒只需要较少量的细胞（低至50,000个）就能开展分析。EpiQ染色质分析试剂盒的流程如下：在有或没有核酸酶的情况下，利用染色质缓冲液处理细胞1小时（37C）。利用终止缓冲液来终止染色质消化（37C，10分钟），之后是基因组DNA纯化和定量。通过实时定量PCR来评估染色质结果，与参照基因比较结果。研究人员证实，EpiQ染色质分析试剂盒的染色质结构数据与多个细胞系中一些基因的表达水平密切相关。他们评估了四个不同细胞系（HeLa、PC3、LNCaP和HCT15）中四个组成型表达基因（GAPDH、ACTB、TBP和B2M）的近启动子区域的染色质状态。每个基因的启动子都处于开放的染色质结构。他们同时评估了同一细胞系中11个表观遗传学调控的基因启动子（ABCB1、CDH1、CDH13、DAPK1、DKK1、GSTP1、PTGS2、TP73、WT1、p14ARF和p16INK4A）（下图B）。染色质状态存在差异，并与基因表达水平密切相关。开放状态的染色质区域与中等到高水平的基因表达相关（右上角黑色框），而封闭状态与低水平相关（左下角）。EpiQ试剂盒轻松鉴定出PC3细胞中一个异常值基因（黑色箭头），它表现出一种表观遗传学调控的稀有形式单等位基因甲基化，即只有一个等位基因被甲基化，导致50%的染色质可接近和高水平基因表达。在目前的表观遗传学研究中，很多研究人员都分析DNA甲基化和组蛋白，而EpiQ试剂盒与这些分析互补。现在就让我们来看看世界各地的科学家是如何利用这个试剂盒的吧。与癌细胞增殖联系起来Ian Marc Bonapace博士是意大利Insubria大学结构与功能生物学系的教授。与一群日本科学家合作，他在上世纪90年代末发现了UHRF1蛋白。那时Bonapace正在寻找调控细胞分化与增殖的蛋白。自UHRF1被发现以后，研究表明它在基因调控中扮演着重要的角色。具体来说，它控制着细胞增殖时重建正确的DNA和染色质修饰的表观遗传学机制。Bonapace研究的主要目标是确定UHRF1最终以何种方式影响了癌症治疗。他们认为，此蛋白至少能作为癌症侵袭性的一个标志物。未来，他们希望能发现一些阻碍UHRF1活性的分子，这有可能作为一种阻止肿瘤生长和转移的方法。在这项研究中，他们使用的主要方法包括染色质免疫沉淀、蛋白抽提和纯化，共沉淀和凝胶过滤，以鉴定此蛋白参与形成了哪些复合物。在2010年初，Bonapace得到了EpiQ试剂盒。为了检验它的效果和适用性，他开展了一个实验，在两个不同的前列腺癌细胞系中比较三个不同的肿瘤抑制基因。这两个细胞系分别为：非侵袭性的LNCAP和侵袭性的PC3。Bonapace谈到：“这些实验的结果正是我们所预计的。LNCAP细胞中肿瘤抑制基因未下调，而PC3细胞中则完全下调（因此染色质处于关闭状态）。”Bonapace还谈到，在得到EpiQ试剂盒之前，使用染色质免疫沉淀方法来确定基因是否表达，一般需要几天。而使用这个试剂盒，你能立即确定基因是否被抑制，之后再决定是否要通过耗时耗力的实验来研究为什么。Bonapace还介绍了EpiQ试剂盒对其研究的潜在影响，不但大大节省时间，还能有效利用资源，因为他不断检测不同类型的细胞和肿瘤，看看同一个目的基因是否受UHRF1蛋白存在或缺失的控制。“这个试剂盒的主要应用不太在于发现什么，而是为了解基因是否表达提供了一个捷径。一旦你了解了这个，你就能设计实验，来更详细地了解为什么是这样，”这位意大利教授如是说。确定HIV潜伏的机制第二个故事的主角是加州大学伯克利分校的研究生Siddharth Dey。有一天，他偶然读到了一篇发表在Cell杂志上的文章，其中Schaffer实验室的研究人员提出了一个HIV潜伏的新模型。他们认为，一种病毒编码蛋白的随机波动可能影响了病毒的潜伏决定，这种蛋白可与病毒RNA发夹结构结合并激活转录，从而形成转录的正反馈环。最初，这些病毒分子在细胞中的数量可能非常低。新模型认为，它可能启动转录的正反馈环，并激活病毒，也可能少量的病毒蛋白未能激活正反馈环，使病毒进入潜伏期。潜伏期病毒对抗病毒药物不敏感，而正反馈环会在迟些时候激活。这个新模型激发了Dey研究病毒蛋白进化的兴趣，并促使他加入了Schaffer实验室。据Dey介绍，HIV被分为多种亚型，且有着非常高的错误率，因此有着非常大的多样性。“我的目标之一是理解这些多样性如何影响功能，以及病毒在多样性之下如何高效运作。是否有一些对病毒功能很重要的潜在结构因素？”在最近的实验中，Dey 研究了一个病毒蛋白，它表现出重要的翻译后修饰，并与多个细胞蛋白相互作用。此蛋白中的一些保守位点已鉴定出，对蛋白功能很关键，如果它们突变，病毒会变得不起作用。Dey想要研究共同进化的位点，即某些位点的氨基酸与其他位点的氨基酸相关联。他的工作需要用序列比对的统计学方法来鉴定那些共同进化的位点。一旦鉴定出，他就能通过实验来检验这些位点。之后再研究它们在结构或功能上如何重要。EpiQ试剂盒在这些功能实验中起了重要作用。研究表明病毒蛋白与多个细胞蛋白相互作用，包括SWI/SNF，一个染色质重塑复合物。Dey解释道：“我试图确定病毒蛋白中的突变如何影响它与染色质重塑因子之间的相互作用。EpiQ试剂盒让我能够评估病毒周围的染色质结构，以及病毒蛋白是否影响它。”过去，Dey使用免疫沉淀来