细菌DNA提取方案.doc

细菌DNA提取方案原理要进行重组DNA 实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备，所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要(意义)。【大家都知道，作为基因工程的载体必须满足下面四个条件：1.是一个复制子，有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；2.他必须要有很高的复制率，这样才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3.有限制性内切酶的识别位点，便于外源基因的插入；4.载体具有选择的遗传标识，以此判断载体是否进入受体细胞，并将其分离出来。因此】基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA 非易事。对于细菌来说，细菌细胞具有坚硬的细胞壁。提取难度将大于真核细胞。细菌基因组DNA在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。（温和操作）。另外制备的DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。DNA不溶于95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 并且用酒精可以洗脱在前几步实验中使DNA携带的盐离子（如何保证高纯度）。对于细菌而言，有染色体DNA和质粒DNA，因此要将其分离开。处理过程中，细菌染色体DNA缠绕在细胞膜碎片上，离心时容易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，上清液中还可能有蛋白质，核糖核蛋白和少量的染色体DNA。大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R10SO3R2蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS 也能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿异戊醇抽提除去。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，回收DNA。此种方法抽提的细菌染色体DNA，无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等。但在下一步实验前，要测定其DNA的浓度，常用测定DNA 浓度的方法，是溴化乙锭电泳法；当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB 会增强发射的荧光。而荧光的强度正比于DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待样品的浓度。本实验利用的就是使用裂解液（含去污剂SDS）将细胞壁破坏，裂解后，用乙醇将DNA沉淀下来。材料：LB液体培养液酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，20密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68蒸馏水饱和，加入8羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTrisCl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，浓度为10mg/ml.于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于20保存。TEG缓冲液：pH8.0 25m mol/L Tris-HCl,10m mol/L EDTA,50m mol/L 葡萄糖,4mg/mL 溶菌酶标准菌株：大肠埃希氏菌碱裂解液：0.2mol/L NaOH,1%SDS乙酸钾溶液、乙酸钠溶液、溶菌酶溶液、丙酮溶液。方法与步骤： 1) 将大肠杆菌接种于LB培养基在37C环境下，以150r/min震荡过夜培养。2) 取1ml对数期菌液，12000rpm 5min； 3) 弃上清，将沉淀溶于200ul丙酮，震荡混匀，冰浴5min。4) 8000rpm离心2min，弃上清。5) 将沉淀混于TEG缓冲液中，震荡混匀，冰浴5min6) 加入200ulSDS裂解液，冰浴5min7) 加入150ul乙酸钾溶液，冰浴15min，使其沉淀完全。8) 4C下离心，12000rpm，5min。（乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并使过量的SDS-Na+转化为溶解度很低的SDS-K+一起沉淀下来。）离心后，若上清液浑浊，应混匀后再冷至0C，重复离心。弃去上清9) 加入等体积的酚-氯仿饱和溶液，反复震荡，离心，12000rpm 2min（比单独用酚，氯仿除去蛋白质效果更好。为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀）。10) 将上清移至新管，加入2倍体积预冷无水乙醇，混合摇匀。11) -20C，15min后，4C下离心12000rpm 5min。12) 1ml 70%冷乙醇洗涤沉淀，然后离心，弃去上清液。13) 干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min14) 2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤(沉淀DNA可以使用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇。)15) 干燥，溶于50ul TE（倒数一二步是我们制备的DNA马上就要用的情况，若需保存，则是在使用之前加入RNase。）革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。实验注意：1.提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤DNA。2.最好是风干。3.最好能够使用新鲜的菌体。过程中注意无菌操作。4.菌量有一定的要求，通常为菌液的OD600=1.9时，取1-2ml就可以了。5.第一步悬浮时，振荡的时间稍长一些（1-2分钟），充分悬浮菌体。6.裂解步骤中，如果不澄清说明菌体没有裂解，可能的原因有：a。菌量太大；b。该菌为厚壁的非革兰氏阴性菌。7.沉淀DNA可以使用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇。8.加洗液Rnase A，量要加足，以防止清洗不净影响