IL-17在单纯疱疹病毒性角膜基质炎中的作用-论文.doc

中文论述摘要IL-17在单纯疱疹病毒性角膜基质炎中的作用 目 的 HSK（herpetic stromal keratitis ，HSK）是人类主要的致盲性眼病之一，是一种由CD4+T细胞介导的免疫病理性疾病，但目前HSK的发病机制尚不完全清楚，对其治疗的有效措施少，本研究观察了IL-17在单纯疱疹性角膜基质炎模型中的表达情况，以及在给予HSK小鼠抗IL-17抗体治疗后角膜炎症反应的变化，并且探讨了IL-17在HSK疾病过程中的作用机制，为进一步研究治疗HSK的有效措施提供新的依据。第一部分 IL-17在HSK小鼠模型中的表达方 法1、 HSK小鼠模型的制备：将1.0106空斑单位的单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus type 1, HSV-1）KOS毒株接种于BALB/C鼠的角膜上,建立HSK动物模型。2、显微镜下在各时间点（第1、3、7、10、14及21d），观察小鼠的角膜混浊程度及新生血管化程度。 3、免疫组织化学染色观察IL-17在角膜中的表达。 4、用流式细胞仪检测各时间点（第1、3、7、10、14及21d）小鼠外周血中IL-17在CD4+T细胞上的表达。 5、应用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。结 果 1、疾病程度观察：观察可见角膜混浊程度及新生血管化程度在第10-14d最严重，14d之后逐渐好转。2、免疫组织化学染色发现HSK小鼠角膜基质层炎性细胞、角膜成纤维细胞胞浆、上皮细胞及内皮细胞胞浆中可见大量IL-17阳性表达。3、流式细胞学检测发现IL-17在HSK小鼠外周血CD4+ T细胞表达升高，在接种后第3d时表达量最高。第二部分 IL-17在HSK疾病过程中的作用方 法1、 HSK小鼠模型的制备：同第一部分。2、 抗IL-17单克隆抗体腹腔注射：PBS组、IgG2A抗体组、抗IL-17抗体组小鼠分别在接种病毒当天及接种病毒后第3d，给予腹腔注射PBS、IgG2A抗体、抗IL-17单克隆抗体。 3、显微镜下在各时间点（第1、3、7、10、14及21d），观察各组小鼠的角膜混浊程度及新生血管化程度。4、HE染色观察各组小鼠角膜的病理学改变。5、用流式细胞仪检测正常小鼠及各时间点（第1、3、7、10、14及21d）各组小鼠外周血中TNF-及NF-B p65在CD4+T细胞上的表达。6、应用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。结 果 1、疾病程度观察：各组角膜混浊程度及角膜新生血管化程度均在第10-14d最严重。PBS组及IgG2A抗体组疾病严重程度接近，抗IL-17抗体组的疾病严重程度明显比前两组轻。 2、角膜组织HE染色观察发现HSV-1接种后IgG2A抗体组小鼠及PBS组小鼠角膜可见角膜上皮层完整，基质层高度水肿增厚，有大量炎性细胞浸润，可见新生血管生成。抗IL-17抗体组角膜炎症反应程度明显比前两组轻。 3、流式细胞学检测发现在小鼠感染HSV-1病毒后，IgG2A抗体组和PBS组中TNF-及NF-B p65的表达均有明显升高，抗IL-17抗体组较前两组仅有轻微升高。结 论 IL-17在HSK小鼠角膜及外周血CD4+T细胞上有表达，且在感染早期呈现高表达状态。IL-17可能通过上调促Th1型细胞的细胞因子TNF-的表达，并且大量激活NF-B促进了HSK的炎症反应。关键词 IL-17；角膜炎；疱疹性；TNF-；NF-B英文论述摘要The action of interleukin-17 on herpetic stromal keratitisObjectiveHerpetic stromal keratitis (HSK)， one of the humans leading causes of blindness, is a immune-mediated inflammatory disease induced by CD4+T cell.However, the pathway of HSK is not yet known. Treatment of HSK remains difficult with few effective specific therapies available.We designed the current study to determine the expression of IL-17 on HSK, the alter of virus-induced corneal inflammation after anti-IL-17 antibody （Ab） treatment during murine HSK. We probe into pathway of IL-17 in HSK which could provid some new proofs for the further study of HSK effective therapies.PART 1 The expression of IL-17 on HSK miceMethods1.HSK models were established with inoculating herpes simplex virus type 1 KOS strain at 1.0106 plague forming unit to corneas of BALB/C mice. 2.The eyes were examined on day 1, 3, 7, 10, 14 and 21 after HSV-1 infection for the corneal stromal opacification and Neovascular-ization by slit- lamp biomicroscopy.3.We observed the expression of IL-17 protein in cornea by immunohistochemistry (IHC).4.By flow cytometry, the expression of IL-17 surface protein on CD4+ T cells in murine peripheral blood was evaluated on 1， 3， 7, 14 and 21d post infection.5.Our results were analysed by SPSS 17.0 software.Results 1.The corneal stromal opacification and the neovascularization were the most serious on 10-14d post infection. 2.We observed that HSK group IL-17 expression was increased in the corneal epithelium, endothelium, corneal fibroblasts by immunohistochemistry (IHC). 3.We observed expression of IL-17 increased on CD4+ T cells in murine peripheral blood of HSK mice by flow cytometry. The peak ofexpression appeared on day 3 post infection.PART 2 The action of IL-17 on HSKMethods 1.HSK models were same to the Part 1.2.The PBS group mice received PBS by intra-peritoneal (IP) injection on days 0d and 3d. The IgG2A Ab group mice received IgG2A Ab by IP injection on days 0d and 3d. The anti-IL-17Ab group mice received anti-IL-17Ab by IP injectionon days 0d and 3d.3.The eyes were examined on day 1, 3, 7, 10, 14 and 21 after HSV-1 infection for the corneal stromal opacification and Neovascularization by slit-lamp biomicroscopy.4.We observed the pathology alter of mice corneas in every group by Hematoxylin eosine staining. 5.By flow cytometry, The every groups levels of TNF- and NF-B p65 expression in CD4+T cells in murine peripheral blood were determined on 0，1， 3， 7, 14 and 21d post infection. 6.Our results were analysed by SPSS 17.0 software.Results 1.The corneal stromal opacification and the neovascularization of every group were the most serious on 10-14d post infection. In IgG2AAb group and PBS group, results of clinical observations were similar.In anti-IL-17 Ab group, more eyes developed both corneal opacity and neovascularization were significantly more light than in IgG2A groupand HSK group. 2.Hematoxylin eosine staining: the cornea in IgG2A Ab group and PBS group showed marked inflammation, obvious edema, profound neovascularization, and significant hypercellularity in the stroma. The level of anti-IL-17 Ab group is lighter than the former two groups. 3.We observed the expression of TNF- and NF-B p65 in IgG2A group and PBS group were increased significantly. The increased level of anti-IL-17 Ab group is lighter than the former two groups.Conclusions IL-17 expression increased both on CD4+T cells murine peripheralblood and corneas of HSK mice. IL-17 induced immune-mediated inflammatory process by up-regulated the expression of TNF- (produced by Th1 cell) and the activity of NF-B.Key wordsIL-17； Keratitis；herpetic； TNF-； NF-B英文缩略语英文缩写英文全称中文全称DABdiaminobenzidine3, 3-二氨基联苯胺DMEMDulbeccos modified Eagles medium达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基HEhematoxylin and eosin苏木精-伊红HSKherpetic stromal keratitis单纯疱疹病毒性角膜基质炎HSV-1herpes simplex virus type 1单纯疱疹病毒1型IHCimmunohistochemistry免疫组织化学IL-17interleukin-17白介素17NF-Bnuclear factor kappa B核因子BPBSphosphate-buffered saline磷酸盐缓冲液PFUplague forming unit空斑单位Th1 cellT help cell 1辅助性T细胞1型Th17 cellT help cell 17辅助性T细胞17型TNF-tumor necrosis factor-肿瘤坏死因子论文IL-17在单纯疱疹病毒性角膜基质炎中的作用前 言单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus type 1, HSV-1）引起的角膜基质炎（herpes stromal keratitis, HSK），是人类主要的致盲性眼病之一，是一种由CD4+T细胞介导的免疫病理性疾病1-3。 HSK疾病发展过程中的炎症反应如角膜基质层混浊、角膜新生血管化及角膜瘢痕导致了不可逆的角膜组织学损伤，最终致盲，但HSK的发病机制尚不完全清楚，IL-17在HSK疾病过程中的具体作用需进一步探讨。最近已有研究发现了一种不同于Th1及Th2的新的CD4+T细胞，该型CD4+T 细胞即Th17细胞产生IL-174。IL-17家族由A-F 6个成员组成(IL-17A-F),IL-17又称IL-17A,是IL-17家族的主要成员5。最近的研究发现，IL-17在许多自身免疫性疾病中的表达量明显增加，并且在疾病的发生、发展过程中发挥了重要的作用6,7，提示IL-17在HSK中可能起到类似的作用。IL-17可以促进T 细胞的激活和刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞产生多种致炎因素(包括TNF-、IL-1、IL-6、IL-8等) ,导致炎症的发生8。本研究采用BALB/c鼠的HSK模型9，观察在小鼠HSK中IL-17的表达，检测了疾病过程中TNF-及NF-b的表达，为进一步研究IL-17在HSK中的作用机制奠定基础。第一部分 IL-17在HSK小鼠模型中的表达材料与方法一、材料 （一）病毒和细胞 病毒为人的高神经毒力的HSV-1 KOS毒株( 中国疾病预防控制中心病毒所提供) ,滴度为每升含1.0106空斑单位( plague forming unit, PFU)。生产和检测病毒的细胞为非洲绿猴肾细胞 (VERO) 。培养VERO的营养液为含体积分数5胎牛血清、青霉素、链霉素的DMEM(美国Gibco公司)。（二）实验动物及分组 选用4-6周，体重18-21g的雌性BALB/c鼠（中国医科大学动物实验室提供）30只作为实验对象。按随机数字表法分为正常对照组（5只）、实验组（25），其中实验组接种HSV-1病毒。 （三）试剂和仪器 1、主要试剂一抗工作液IL-17多克隆抗体 （北京博奥森生物技术有限公司）S-P超敏试剂盒 （福州迈鑫生物技术公司）柠檬酸、柠檬酸钠、过氧化氢液 （北京中杉公司）PBS、DAB显色剂 （北京中杉公司） 溶血素 （美国R&D 公司） APC标记的抗小鼠CD4抗体 （美国eBioscience公司） PE标记的抗小鼠IL-17抗体 （美国eBioscience公司） PE标记的IgG2A同型对照抗体 （美国eBioscience公司） 2、主要器材设备 手术显微镜 （苏州六六仪器公司）台式冷冻离心机 （美国Thermo公司）FACS Calibur流式细胞仪 （美国Becton-Dickinson公司）快速混匀仪 （美国Thermo公司）TS-12F生物组织自动脱水机 （湖北省医用电子仪器厂）SAKURA Tissue-TekTEC包埋机 （日本SAKURA公司）2035 Jung Broeut切片机 （德国Leiea公司）OLYMPUSB201显微镜成像系统 （日本OLYMPUS光学有限公司）眼科剪、镊子、1ml一次性使用无菌注射器、烘箱、恒温培养箱、4冰箱、载玻片、盖玻片、封片胶、切片架、染色缸、湿盒、1.5mlEppendorf管、流式管、微量移液器、加样头。二、方法 （一）HSK模型的建立 将实验组小鼠麻醉后置于显微镜下；用1号无菌针头交叉划伤右眼角膜上皮层呈 “#” 字形,将5l含有1.01 0 6PFU病毒的DMEM滴于鼠的右眼角膜表面，同时轻轻按摩鼠睑9。（二）疾病程度观察 分别于鼠角膜接种HSV-1后第1d、3d、7d、10d、14d及21d，用显微镜检查角膜改变。评估角膜基质炎的标准( 04分) 。0分：角膜基质清晰透明；1分：角膜基质稍混浊；2分：角膜基质中度混浊， 可透见后部虹膜特征；3分：角膜基质重度混浊，但仍可判断瞳孔缘 的位置；4分：角膜基质完全混浊，失去后部特征10。(2)角膜新生血管的判分标准:0分,无新生血管长入角膜;1分,新生血管向心性生长,但未达到瞳孔中央或未超过角膜半径;2分,新生血管达到瞳孔中央或超过角膜半径11。 （三）免疫组织化学染色 1、取材HSV-1接种后各时间点（第1、3、7、10、14及21d）取实验组小鼠右眼球（每个时间点取5只小鼠）及5只正常对照组小鼠眼球。 2、固定 将眼球放置于固定液(无水乙醇60mL、体积分数10%中性甲醛10mL、冰醋酸10mL、氯仿20mL混匀)中固定。固定两小时后去除晶体、巩膜等组织，留角膜继续固定至24小时。 3、组织块的脱水、透明及石蜡包埋 在常温下脱水乙醇浓度如下：75%酒精85%酒精80%酒精95%酒精95%酒精100%酒精100%酒精 3次纯二甲苯溶液透明，每次15分钟 使用低温蜡，在60以下浸透 浸透后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡倒入包埋盒，冷却后取出，修块。 4、石蜡切片的制备 切片:切片机切片，切片厚度:5m 展片:切片放入水浴锅中展开 捞片:用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片 切片干燥:37温箱过夜，干燥 5、石蜡切片的脱蜡及水化 脱蜡:二甲苯15min二甲苯15min二甲苯15min 水化:100%酒精10min100%酒精10min90%酒精5min80%酒精5min70%酒精5min蒸馏水洗涤三次，每次三分钟 6、抑制内源性过氧化物酶活性 将切片放入10%H2O2中10min(溶液为蒸馏水)，蒸馏水洗涤切片，每次3min，共3次 7、抗原修复 将切片放入高压修复液（2.101g/100ml柠檬酸、24.705g/100ml柠檬酸钠混合液）中，放入高压锅高压修复2min，PBS液洗涤切片，每次3min，共3次 8、用与二抗来源相同的兔非免疫血清孵育切片15min。 9、用兔抗小鼠IL-17多克隆抗体一抗工作液(与PBS稀释倍数为1:400)孵育切片，4过夜，PBS液洗涤切片，每次3min共3次。 10、用生物素标记的羊抗兔IgG二抗工作液孵育切片15min，PBS液洗涤切片，每次3min共3次。 11、滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液孵育切片15min，PBS液洗涤切片，每5min共4次。滴加卵白素-生物素-过氧化物酶复合物和3, 3-二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色，室温显色。 13、镜下控制反应时间，自来水冲洗终止反应。 14、苏木素复染5min，自来水浸20min。15、 切片脱水、透明，树胶封片。阳性细胞呈棕黄色。用0.01mol/L PBS代替一抗孵育,作为阴性对照。光学显微镜下观察并照相。 （四）流式细胞学检查三组均于HSV-1接种后各时间点（第1、3、7、10、14及21d）分别取5只小鼠采血，取5只正常对照组小鼠采血。采血方法：用毛细管取小鼠的左眼眼眶静脉窦血1ml，置于抗凝采血管中，充分混匀。 1、正常对照组小鼠及实验组每份血样取200l血，每100l血置于一个Eppendorf管中，共分为2管。分别加入相应荧光抗体：第1管中依次加入1l APC标记的抗小鼠CD4抗体（CD4-APC）和PE标记的IgG2A同型对照抗体（PE-IgG2A）,第2管中依次加入1l CD4-APC抗体和PE标记的抗小鼠IL-17抗体（IL-17-PE）。第1管为第2管的阴性对照。 3、各管震荡混匀后室温避光静置30min。 4、加稀释后溶血素（溶血素与去离子水比例为1:9）1ml于各管中，充分混匀后避光静置10min。 5、上离心机以300g，离心5min。弃上清液，加PBS至1.5ml，混匀后再次离心5min，弃上清液。 6、向各管中加入200l PBS混匀后，移至流式管中，上流式细胞仪检测。 应用FACS Calibur流式细胞仪，用Cell Quest软件进行检测和分析，确定各组CD4+IL-17+T细胞阳性率。 （五）统计学分析 采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。实验中检测指标的数据资料以xs表示。各组数据资料的方差齐性检验采用Levene分析。方差齐各组组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验；方差不齐各组组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间多重比较采用Nemenyi检验。P0.05为差异有统计学意义。结 果1、 HSK疾病程度观察小鼠角膜接种HSV-1后，裂隙灯观察各时间点（第1、3、7、10、14及21d）的平均角膜混浊程度和角膜新生血管化程度。正常对照组小鼠角膜光滑透明（图1A）,实验组在HSV-1接种后第3d可见角膜上皮光滑，轻微角膜基质层灰白色混浊，未见新生血管形成。HSV-1接种第14d可见角膜上皮光滑，严重的角膜基质层灰白色混浊及角膜缘向瞳孔生长的新生血管（图1B）。第14d以后角膜混浊程度减轻，新生血管化程度逐渐减轻。观察可见角膜混浊程度及新生血管化程度在第10-14d最严重，14d之后逐渐好转（图2A、B)。BA 图1，显微镜下疾病程度观察。A：正常对照组小鼠；B：HSV-1接 种后第14d小鼠 BA 图2，显微镜下观察HSV-1接种后各时间点的小鼠疾病程度。 A：平均角膜混浊程度；B：平均角膜新生血管化程度 二、免疫组织化学染色检测IL-17在角膜中的表达IL-17在角膜组织各种细胞的表达呈棕褐色。正常小鼠角膜上皮层细胞、内皮细胞及角膜成纤维细胞胞浆中可见IL-17阳性表达（图3B）。HSV-1接种后第14d小鼠角膜基质层炎性细胞、角膜成纤维细胞胞浆、上皮细胞及内皮细胞胞浆中可见大量IL-17阳性表达（图3C）。在小鼠HSK炎症反应过程中IL-17表达于小鼠角膜的基质层炎性细胞、角膜成纤维细胞胞浆、上皮细胞及内皮细胞胞浆。CBA图3，IL-17在小鼠角膜中的阳性表达呈棕褐色（箭头）。A：阴性对照；B：正常对照组；C：接种HSV-1后第14d。免疫组化400三、流式细胞学检测IL-17在HSK小鼠外周血CD4+ T细胞上的表达我们采用流式细胞学检查的方法检测IL-17在HSK组小鼠各时间点外周血中CD4+T淋巴细胞上的表达。结果显示在小鼠感染HSV-1病毒后，各个时间点IL-17在小鼠外周血CD4+T细胞表达与正常小鼠（第0d）比较均有升高，在接种后第3d时表达量最高，表达上升明显，第3天后逐渐下降（图4）。第3d、10d及14d与正常小鼠（第0d）比较差异有统计学意义（P0.05）。在第0dIL-17表达百分比为0.41%，在第3dIL-17百分比为3.51%（图5）。小鼠感染HSV-1后IL-17在外周血中CD4+ T淋巴细胞上的表达升高，且在感染早期呈现出高表达。* 图4，IL-17在HSK小鼠各时间点外周血中CD4+T淋巴细胞上的表 达的百分比*P0.05与正常小鼠（第0d）比较 图5，正常小鼠（第0d）及接种后第3dIL-17 在小鼠外周血中 CD4+T淋巴细胞上的表达的百分比第二部分 IL-17在HSK疾病过程中的作用材料与方法一、材料 （一）实验动物及分组 选用4-6周，体重18-21g的雌性BALB/c鼠（中国医科大学动物实验室提供）115只作为实验对象。按随机数字表法分为正常对照组（7只）、PBS组（36只）、抗IL-17抗体组（36只）、IgG2A抗体组（36只）。 （三）试剂和仪器 1、主要试剂 苏木素 （北京中杉公司）伊红 （北京中杉公司）PBS （北京中杉公司） 抗IL-17单克隆抗体 （美国R&D 公司） IgG2A对照抗体 （美国R&D 公司） 溶血素 （美国R&D 公司） APC标记的抗小鼠CD4抗体 （美国eBioscience公司) PE标记的抗小鼠TNF-抗体 （美国eBioscience公司） PE标记的抗小鼠NF-B P65抗体 （美国eBioscience公司） PE标记的IgG同型对照抗体 （美国eBioscience公司） 2、主要器材设备 同第一部分。2、 方法 （一）HSK模型建立三组小鼠HSK模型建立具体方法同第一部分。 （二）抗IL-17单克隆抗体腹腔注射PBS组小鼠在接种病毒当天及接种病毒后第3d，给予腹腔注射100lPBS。IgG2A抗体组在接种病毒当天及接种病毒后第3d，给予腹腔注射100l（1g/l）IgG2A抗体。抗IL-17抗体组在接种病毒当天及接种病毒后第3d，给予腹腔注射100l（1g/l）抗IL-17单克隆抗体。（三）疾病程度观察 分别于鼠角膜接种HSV-1后第1、3、7、10、14及21d，用显微镜检查各组小鼠角膜改变。评估角膜基质炎的标准及角膜新生血管的标准同第一部分。 （五）HE染色 HSV-1接种后各时间点（第1、3、7、10、14及21d）取各组小鼠右眼球及正常小鼠眼球。HE染色不需抗原修复，盐酸酒精分化后伊红染色，余与第一部分免疫组化相同。 （六）流式细胞学检查三组均于HSV-1接种后各时间点（第1、3、7、10、14及21d）分别取6只小鼠采血。取6只正常小鼠采血。采血方法：用毛细管取小鼠的左眼眼眶静脉窦血1ml，置于抗凝采血管中，充分混匀。1、各组每份血样取400l血，每100l血置于一个Eppendorf管中，共分为4管。2、向各组各管分别加入相应荧光抗体：第1管中依次加入1lCD4-APC和PE标记的IgG同型对照抗体（PE-IgG）,第2管依次加入1l CD4-APC抗体和PE标记的抗小鼠TNF-抗体（TNF-PE）；第3管中依次加入1lCD4-APC和PE-IgG,第4管依次加入1l CD4-APC抗体和PE标记的抗小鼠NF-B P65抗体（NF-B P65-PE）。单数管为双数管的阴性对照。 3、各管震荡混匀后室温避光静置30min。 4、加稀释后溶血素（溶血素与去离子水比例为1:9）1ml于各管中，充分混匀后避光静置10min。 5、上离心机以300g，离心5min。弃上清液，加PBS至1.5ml，混匀后再次离心5min，弃上清液。 6、向各管中加入200l PBS混匀后，移至流式管中，上流式细胞仪检测。 应用FACS Calibur流式细胞仪，用Cell Quest软件进行检测和分析，确定各组CD4+TNF-+ T细胞阳性率及CD4+NF-B+T细胞阳性率。 （七）统计学分析 统计学方法同第一部分。结 果一、疾病程度观察小鼠角膜接种HSV-1后，裂隙灯观察各时间点（第1、3、7、10、14及21d）的平均角膜混浊程度和角膜新生血管化程度。各组角膜混浊程度均在第10-14d最严重(图5A)，角膜新生血管化程度均在第10-14d最严重(图5B)。PBS组及IgG2A抗体组疾病严重程度接近，抗IL-17抗体组的角膜混浊程度及新生血管化程度明显比PBS组及IgG2A抗体组轻（P0.05）。（图5A、B）给予抗IL-17抗体治疗后，疾病程度明显减轻。BA*# #*#*#*#*#*#*# 图5，显微镜观察HSV-1感染后各时间点的各组小鼠疾病程度。 A：平均角膜混浊程度；B：平均角膜新生血管化程度 *P0.05与PBS组比较，#P0.05与IgG2A抗体组比较 二、角膜组织HE染色 正常小鼠角膜角膜上皮完整，未见炎性细胞浸润及基质层水肿（图6A）。HSV-1接种后第14dIgG2A抗体组小鼠及PBS组小鼠角膜可见角膜上皮层完整，基质层高度水肿增厚，有大量炎性细胞浸润，主要由淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞构成，可见新生血管生成（图6B、C）。HSV-1感染后第14d抗IL-17抗体组可见基质层轻度水肿增厚，少量炎性细胞浸润，炎症反应程度明显比IgG2A抗体组小鼠及PBS组轻（图6D）。给予抗IL-17抗体治疗后，炎症细胞浸润明显减少，基质层水肿明显减轻，炎症反应程度明显减轻。BA DC 图6，角膜标本的HE染色。A：正常对照；B：接种后第14d IgG2A 抗体组；C：接种后第14dPBS组；D：接种后第14d抗IL-17抗体 组。HE 400 三、流式细胞学检测TNF-及NF-B p65在各组小鼠外周血CD4+ T细胞上的表达A 我们采用流式细胞学检查的方法检测TNF-及NF-B p65在接种HSV-1各组小鼠外周血中CD4+T淋巴细胞上的表达。结果显示在小鼠接种HSV-1病毒后，IgG2A抗体组和PBS组TNF-及NF-B p65的表达均有明显升高，抗IL-17抗体组的TNF-及NF-B p65的表达仅有轻微升高，TNF-的表达在HSV-1接种后第10-14d达高峰（图7A、B）。在接种HSV-1后的各时间点（第1、3、7、10、14及21d），抗IL-17抗体组TNF-及NF-B p65的表达明显少于IgG2A抗体组及PBS组。抗IL-17抗体组与PBS组比较差异有统计学意义（P0.05），抗IL-17抗体组与IgG2A抗体组比较差异有统计学意义（P0.05）。在接种HSV-1病毒后的第10d，TNF-表达百分比在IgG2A抗体组为3.18%，在PBS组为3.27%，在抗IL-17抗体组为0.39%（图8A）;NF-B p65表达百分比在IgG2A抗体组为1.33%，在PBS组为1.05%，在抗IL-17抗体组为0.19%（图8B）。小鼠感染HSV-1后外周血中CD4+ T淋巴细胞上TNF-及NF-B p65的表达明显升高，给予抗IL-17抗体治疗的小鼠TNF-及NF-B p65的表达明显减少。AB*#*#*#*#*#*# *#*#*#*#*#*#图7，TNF-及NF-b p65在各组小鼠外周血CD4+T细胞上表达的 百分比。A：TNF-在各组小鼠外周血CD4+T细胞上表达的 百分比；B：NF-B p65在各组小鼠外周血CD4+T细胞上表 达的百分比 *P0.05与第0d比较 *P0.05与PBS组比较， #P0.05与IgG2A抗体组比较BA 图8，接种HSV-1后第10d，TNF-及NF-B p65在各组小鼠外 周血中CD4+T淋巴细胞上的表达的百分比。A：TNF-在外周血中CD4+T淋巴细胞上的表达的百分比；B：NF-B p65在外周血中CD4+T淋巴细胞上的表达的百分比 讨 论 HSK是HSV-1介导的以免疫炎症反应和细胞效应共同作用为特征的角膜疾病,主要是由病毒抗原引起的T 淋巴细胞介导的迟发型变态反应，其多种发病机制备受关注，其中CD4+T细胞介导单纯疱疹病毒性角膜基质炎是主要的发病机制。鼠的 CD4+T细胞，根据其分泌细胞因子的不同分为两类：Thl细胞和Th2细胞。Thl细胞产生IL-2、IFN-和TNF-介导细胞免疫；Th2细胞产生IL-4，IL-6和IL-10，介导体液免疫12。大量的证据表明,Th1型细胞在介导HSK免疫性炎症反应过程中起着主要的作用13。 IL-17是一种致炎细胞因子,可以促进T细胞的激活和刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞产生多种致炎因素(包括IL-1、IL-6、IL-8、TNF-、粒细胞集落刺激因子、前列腺素E2、金属蛋白酶和化学增活素等) ,导致炎症的发生8。IL-17在炎症反应中有着重要的作用，特别是在在宿主免疫的感染性疾病以及过敏和自身免疫反应中13。研究表明IL-17蛋白在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠模型中呈高表达，IL-17阳性表达细在EAU的发病过程中起一定作用14。 我们的研究结果显示，HSV-1感染后HSK小鼠角膜基质层炎性细胞、角膜成纤维细胞胞浆、上皮细胞及内皮细胞胞浆中可见大量IL-17阳性表达。小鼠感染HSV-1后IL-17在外周血中CD4+T淋巴细胞上的表达升高，且在感染早期呈现出高表达（研究结果示第3d达最高）。HSV-1感染后病理学检查可见抗IL-17抗体组基质层轻度水肿增厚，少量炎性细胞浸润，明显比IgG2A抗体组小鼠及PBS组反应轻，观察疾病程度也可见抗IL-17抗体组的炎症反应程度明显比其他两组轻。这就说明在HSK中抗IL-17抗体的治疗明显减轻了炎症反应，也就是说IL-17在HSK中有着促进炎症反应的作用。但是究竟是通过什么机制促进了炎症反应尚不清楚。 已有的研究表明，很多促炎的介质如TNF-，在HSK疾病过程中加强了宿主免疫应答15。NF-B是一种可诱导的转移因子，哺乳动物包含了5种NF-B蛋白，包括P50,P52,P65,Rel-B等16。几篇文献一致说明在HSK的角膜上NF-B有明显持续的上调17。NF-B p65与导致角膜新生血管化和角膜混浊的角膜炎症有关系15。很多研究表明IL-17的表达和TNF-的产生有着明显的联系，在一些系统中已经发现了IL-17直接刺激了TNF-的释放18。TNF-和IL-1炎症因子是NF-B强有力的活化剂19。TNF-的表达与NF-B的活性有关，TNF-在HSK疾病发展的慢性炎症和组织损伤过程中大量产生20。现在的研究表明IL-17激活了NF-b,并且IL-17直接介导NF-B活性作用与TNF-和IL-1相比是比较微弱的21,22。 在我们的研究中，结果显示，小鼠感染HSV-1后外周血中CD4+T淋巴细胞上TNF-及NF-B p65的表达明显升高，在给予HSK小鼠抗IL-17抗体治疗后，与IgG2A抗体组小鼠及PBS组相比TNF-及NF-B p65的表达明显减少。也就是说在HSK炎症反应过程中，TNF-及NF-b p65的表达是升高的，而IL-17的减少使得TNF-及NF-B p65的表达也明显减少，从而减轻了抗IL-17抗体组的炎症反应。我们可以得出结论：HSK中IL-17的表达升高，而IL-17又促进了TNF-及NF-B p65的产生。由于NF-B主要是由TNF-激活后产生促炎的作用，而直接由IL-17激活产生的作用很微弱，所以认为，IL-17在促进了Thl细胞产生TNF-后，一方面TNF-激活了NF-B而产生了促进HSK炎症反应的作用，另一方面TNF-本身也有加强HSK宿主免疫应答的作用。于此同时，IL-17和TNF-在导致HSK的炎症损伤上、召集中性粒细胞加强固有免疫的作用上还可能有着协同的作用23,24。因此我们的研究认为，HSK中IL-17的表达升高，IL-17是通过促进了Th1型细胞的细胞因子TNF-的产生而导致炎症反应，这与我们所知的Th1型细胞在介导HSK免疫性炎症反应过程中起着主要的作用的说法相一致。由于HSK的发病机制尚不确定，临床上治疗方法比较单一，常采用激素类药物治疗来控制免疫炎症反应，目前我们的研究发现IL-17促进HSK炎症反应的机制，有望成为未来HSK治疗的新靶点。结 论IL-17在HSK小鼠角膜及外周血CD4+T细胞上有表达，且在感染早期呈现高表达状态。IL-17可能通过上调了Th1型细胞的细胞因子TNF-的表达，以及大量激活NF-B促进了HSK的炎症反应。本研究创新性自我评价IL-17作为新进发现的Th17细胞产生的细胞因子，在眼科领域的研究刚刚起步，IL-17在HSK发病中的具体机制未见相关报道，研究IL-17促进HSK炎症反应的机制为以后的治疗提供新的依据。参考文献1 Kaye S, 1 Kaye S, Choudhary A. Herpes simplex keratitis. Prog Retin Eye Res,2006,25(4)355-380.2 InoueY.Immunological aspects of herpetic stromal keratitis. Semin Ophthalmol,2008,23(4)221-227.3 夏丽坤,舒红,高殿文.鼠T淋巴细胞亚群对复发性单纯疱疹病毒性基质性角膜炎 的免疫介导作用.中华眼科杂志, 2000,36(1)27-31.4 Harrington LE, Mangan PR, Weaver CT. Expanding the effector CD4 T-cell repertoire: the Th17 lineage. Curr Opin Immunol,2006,18(3):349-356.5 Pappu BP, Angkasekwinai P, Dong C.Regulatory mechanisms of helper T cell differentiation: new lessons learned from interleukin 17 family cytokines. Pharmacol Ther,2008,117(3):374-384.6 Kirkham B W, Lassere M N , Edmonds J P , et al. Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis: A two-year prospective study (the DAMAGE study cohort).Arthritis Rheum, 2006,54(4):1122-1231.7 唐碧霞,唐福林. IL-17 与自身免疫性疾病关系的研究进展.基础医学与临床,2008,28(1):94-97.8 Faria AM,Weiner HL. Oral tolerance: therapeutic implications for autoimmu