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细胞划痕实验 一 基本原理细胞划痕 WoundHealing 法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法 类似体外伤口愈合模型 在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上 用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线 去除中央部分的细胞 然后继续培养细胞至实验设定的时间 例如24h 取出细胞培养板 观察周边细胞是否迁移 修复 至中央划痕区 以此判断细胞的生长迁移能力 实验通常需设定正常对照组和实验组 实验组是加了某种处理因素或药物 外源性基因等的组别 通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同 可以判断各组细胞的迁移与修复能力 二 实验步骤准备 所有能灭菌的器械都要灭菌 直尺和marker笔在操作前紫外照射30min 超净台内 1 先用marker笔在6孔板背后 用直尺比着 均匀得划横线 大约每隔0 5 1cm一道 横穿过孔 每孔至少穿过5条线 2 在孔中加入约5 105个细胞 具体数量因细胞不同而不同 掌握为过夜能铺满 3 第二天用枪头比着直尺 尽量垂至于背后的横线划痕 枪头要垂直 不能倾斜 不同孔之间最好使用同一枪头 4 用PBS洗细胞3次 去掉划下的细胞 加入无血清或低血清培养基 5 放入37度5 CO2培养箱 培养 按0 6 12 24小时取样 拍照 cultureInsert方法 保证划痕的均一度 1 准备细胞 培养液 2 如图 将细胞接种于Dish中间的Insert 细胞长满Insert区域后用镊子移除Insert即可产生500 m宽度的划痕 3 每隔4 6小时拍照记录 4 根据收集图片数据分析实验结果 细胞定位格子培养皿 三 实验结果统计方法 使用ImageJ软件打开图片后 随机划取6至8条水平线 计算细胞间距离的均值 测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度 其他结果分析工具 WoundHealingImageAnalysis WimScratchImageProPlus 划痕结果图 0h 6h 12h 24h 小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3 四 注意事项 1 在用PBS缓冲液冲洗时 注意贴壁慢慢加入 以免冲散单层贴壁细胞 影响实验拍照结果 2 一般做划痕实验 都是无血清或者低血清 2 否则细胞增殖就不能忽略 也可用丝裂霉素处理一小时 3 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕 可以形成若干交叉点 作为固定的检测点 以解决了前后观察时位置不固定的问题 特点 1 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程 2 价格低廉 操作简单 还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯 容易控制 3 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容 可用于分析细胞间的相互作用 4 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法 举例 抗肿瘤药物5 氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响 细胞划痕法 一 实验原理 细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动特性方法之一 其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型 在体外培养的单层细胞上划痕致伤 加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力 二 实验材料 1 细胞系及其培养 肝肿瘤细胞HepG22 24孔板移液器倒置显微镜3 主要试剂 PBSDMEM培养液0 25 胰酶胎牛血清5 氟尿嘧啶溶液 1ug ml 三 实验步骤1 制备单层细胞 细胞密度5 10 105 mLHepG2细胞铺于24孔板 每孔500uL 上 加入含10 胎牛血清的DMEM培养液培养16 24h 使形成单层细胞2 划痕 以五氟尿嘧啶 5 Fu 为例 首先配制1 g L母液 使用无菌蒸馏水配制 精密量取 取45 L该母液用PBS稀释至1 1mL 得浓度40 g mL5 Fu溶液 用10uL移液枪枪头 或者无菌牙签 在单层细胞上呈一字划痕 用PBS清洗3次 然后加入上面配好5 Fu溶液 平行两个样本 孵育24h 换成含10 胎牛血清的DMEM培养液孵育24h3 观察并拍照 吸去培养液 用PBS清洗3次 倒置荧光显微镜下观察并拍照 四 注意事项 1 实验时应注意细胞生长状况 选择适当细胞接种浓度 对不同细胞要观察细胞贴壁率等 确定实验时细胞的接种数量和培养时间 保证培养终止时密度适当 2 用PBS缓冲液冲洗时 注意贴壁慢慢加入 免冲散单层贴壁细胞影响实