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紫外分光光度计 原理及应用紫外分光光度计*简 介紫外分光光度计是每个化学分析实验室必备的常用仪器设备之一，适用于对紫外、可见光谱区域内物质的含量进行定量和定性分析，可广泛应用于工厂、学校、冶金、农业、食品、生化、环保、石油化工、医疗卫生等单位的基础实验室。紫外分光光度计*历史发展1852 年，比尔(Beer)参考了布给尔(Bouguer)1729 年和朗伯(Lambert)在 1760 年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的强度 与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分光光度法的理论基础，这就是著名的朗伯比尔定律。1854 年，杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)等人将此理论应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到 1918 年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光度法的灵敏 度和准确度也不断 提高，其应用范围也不断扩大。 紫外可见分光光度法从问世 以来，在应用方面有了很大的发展，尤其是在相关学科发展的基础上，促使分光光度计仪器的不断创新，功能更加齐全，使得光度法的应用更拓宽了范围。紫外分光光度计*工作原理紫外分光光度法定量测定的依据是比耳定律，即物质 在一定浓度 的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比 。许多有机化合物在紫外区具有特征的吸收光谱，因此可用紫外分光光度法对有机物质进行定性鉴定，结构分析及定量测定.其基本工作原理和红外光谱仪相似，利用一定频率的紫外-可见光照射被分析的有机物质，引起分子中价电子的跃迁，它将有选择地被吸收。一组吸收随波长而变化的光谱，反映了试样的特征。在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。分光光度分析就是根据物质的吸 收光谱研究物质 的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外分光光度计*种 类分光光度计从分光元件来讲可分为棱镜式和光栅式两种，也有光栅加棱镜的高档分光光度计，现今的分光光度计大部分采用光栅分光。从结构上来区分可分为单光束、准双光束、双光束和双波长分光光度计紫外分光光度计*特 点强劲的仪器性能：极其优良的光学系统，先进的电子学系统，高水准的机械系统，保证了0.010%T的超低杂散光。稳定可靠的品质：双光束动态反馈比例记录测光系统保证了基线稳定性。氘灯、光电倍增管等关键器件均用进口件，保证仪器的稳定可靠和长寿命。精准的测量：采用进口优质全息光栅，进一步降低仪器的杂散光，使仪器分析更加准确。轻松高效的人机对话：基于Windows环境设计的UVWin中文操作软件，提供了丰富的仪器控制和操作功能，简单易用，灵活高效，轻松满足使用者的分析需求。优异的可扩展性：有蠕动进样器、超微量池架、恒温池架、光学积分球、镜面反射、光纤附件和比色皿系列等大量用户可选专用附件，使仪器的应用范围大大扩展。设备维护简单方便：独特的插座式钨灯和氘灯，换灯时免去光学调试，使设备仪器调试、维护更加简单方便。强大而便捷的软件分析助手UVWin5.0先进的Windows多文档界面，UVWin5.0控制软件，能够实现多模式同时显示，测量方式切换瞬间完成。主体界面提供所有的功能，是用户进行软件操作的基础。包括：菜单、工具按钮、测量模块、状态信息等。 四大常规测量功能光度测量、定量测定、光谱扫描、时间扫描 三维谱图功能提供将多次测量的光谱曲线组合为三维图形进行显示、编辑和打印的功能。 DNA蛋白质测定功能用户可以利用此功能对DNA/蛋白质进行浓度测量，同时还可以设置不同分析方法，从而满足不同的需要。 软件遵循GLP规范多用户管理：允许管理员创建拥有不同权限的用户和组;每个用户登陆软件需要输入相应的帐号和密码;针对一般用户可实现测量数据的保护功能。日志记录功能：自动记录用户的操作;日志文件采用更为可靠的数据库格式保存;管理员可对日志进行分类查阅和其他处理。二进制文件保存：测量数据的保存格式采用二进制格式;二进制格式大大加强了数据的保密程度;同时也节省了磁盘空间。质量控制功能：可根据用户的设置对测量数据进行监控;超出控制范围的数据系统将会显示提示信息、进行颜色标记或自动重新测量。报告输出功能：可实现与其他系统共享数据的功能;可将测量结果保存为Microsoft Word格式、Microsoft Excel格式、文本文件格式;可对报告格式进行个性化的设置;可提前预览结果报告的打印效果。高灵敏度-世界独一无二的三检测器系统：安装三个检测器：光电倍增管用于紫外区和可见区;InGaAs和PbS检测器用于近红外区。InGaAs检测器覆盖了光电倍增管和PbS检测器的薄弱范围，保证了整个测量范围的高灵敏度。高分辨率-宽测试范围和超低杂散光：采用高性能的双单色器实现了超高的分辨率和超低的杂散光。测量范围覆盖紫外、可见和近红外区域，满足多种领域的测量要求。UVProbe实现了真正的QA/QC功能，完全支持GLP、GMP。另外还可以加载膜厚测定、色彩分析等软件。紫外分光光度计*技术参数波长范围：190 nm1100 nm光源：进口钨灯 进口氘灯光学系统：双光束 1200 线平面光栅透射比准确度：0.5%T透射比重复性：0.2%T波长准确度：0.3 nm波长重复性： 0.1 nm杂散光 0.05 %T (220 nm NaI 溶液)光度范围 -3 A3 A噪声： 0.0003 Abs/h基线平直度：0.0005A光谱带宽：1nm漂移： 0.0004 Abs/h光度准确度 0.3 %T (0100 %T)光度重复性 0.001 Abs (00.5 Abs)测量模式：透光率 吸光度 能量 反射率显示方式：通过连接 PC，方便您的存储和操作方便扫描方式：快 中 慢 三档可调波长及设置方式：任意设定键盘：薄膜式按键检测器：进口硅光电池电源：AC 220V/50Hz 或 AC110V/60Hz主机：重量 30kg 仪器尺寸：658*468*264紫外分光光度计*应 用1 检定物质根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长虽 ax 和摩尔吸收系 数是检定物质的常用物理参数。这在药物分析上就有着很广泛的应用。在国内外 的药典中，已将众多的药物紫外吸收光谱的最大吸收波长和吸收系数载入其中，为药物分析提供了很好的手段。2 与标准物及标准图谱对照将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测 定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标 准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密 度高，且测定条件要相同。3 比较最大吸收波长吸收系数的一致性4 纯度检验5 推测化合物的分子结构6 氢键强度的测定实验证明，不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同，这可以利用紫外光谱来 判断化合物在不 同溶剂中氢键强度，以确定选择哪一种溶剂 。7 络合物组成及稳定常数的测定8 反应动力学研究9 在有机分析中的应用有机分析是一门研究有机化合物的分离、鉴别及组成结构测定的科学，它是 在有机化学和分析化学的基础上发展起来的综合性学科。紫外分光光度计*用 途紫外-可见光谱仪涉及的波长范围是0.2-0.8微米(对应波数50000-12500厘米-1)，它在有机化学研究中得到广泛的应用。通常用作物质鉴定、纯度检查，有机分子结构的研究。在定量方面，可测定结构比较复杂的化合物和混合物中各组分的含量，也可以测定物质的离解常数，络合物的稳定常数，物质分子量鉴别和微量滴定中指示终点以及在高效液相色谱中作检测器等。主要使用范围是凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得 的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。目前，广泛应用于冶金、机械、化工、医疗卫生、临床检验、生物化学、环境保护、食品、 材料科学等领域的生产， 教学和科研工作中，紫外分光光度计*选择方法我们在选择各种仪器时，都有一定的标准，如测量精度、或者测量范围。而在选择紫外分光光度计时，我们考虑的是光学构造、光谱范围、样品类型和分析工具。光学构造主要是指紫外分光光度计给出的光是单光束还是双光束。单光束是通过单束光进行测量，在测量过程中给定波长，然后通过被测物和对照物得到吸光结果。而双光束是通过一个斩光轮将光束一分为二。光源包括红外线、紫外线和可见光。钨灯和卤素灯一般只覆盖可见光部分(大约380 nm 到800 nm)。而氙灯则可以覆盖紫外光和可见光区域。分光光度计通常使用光电倍增管和光敏二极管来测量吸光值。在大部分的样品类型中，分光光度计可接受样品孔、小玻璃管cuvette、吸浆管和微孔板。大部分单机型的分光光度计包含了驱动仪器运行和管理数据的软件。高性能的仪器，通常与PC机一起联用，需要从制造商提供额外的软件。同时用户也可以选择升级软件以满足他们的需要。紫外分光光度计*检验方法一、波长准确度的检验 用干涉滤光片或镨钕滤光片测量仪器的吸收峰值, 如果测出的值与滤光片标准值之差超出规程规定, 则需要进行波长调节二、 透射比正确度的检验 用透射比标准值分别为10% 、20% 、30 %左右的光 谱中性滤光片, 可见光区分别在440、546、635nm 波长处,空气为参比, 分别测量各滤光片的透射比, 紫外光区用重铬酸钾溶液分别在235 、257、313、 350nm 波长处, 以高氯酸溶液为参比, 测量其透射比。三、稳定度的检验 在零点不受光的条件下, 用零点调节器将仪器调至零 点, 观察3 分钟读取透射比的变化, 即为零点稳定性。 在仪器测量范围两端向中间靠10nm 处, 调节零点后, 盖上样品室盖( 打开光门) , 使光电管受光, 调节透射 比为95% ( 数显仪器调至100% ) 观察3 分钟读取透 射比的变化, 即为光电流稳定性。四、 杂散光的检验 可见分光计棱镜式仪器在420nm 处, 光栅式仪器在 360nm 处, 紫外分光计在220nm 处分别用符合规定 的截止滤光片, 以空气为参比, 测量其透射比值, 即为 仪器在相应波长下的杂散辐射率紫外分光光度计*操作方法一、开机开机前将样品室内的干燥剂取出，确认电源是否连接。打开仪器电源开关，等待仪器自检通过，自检过程中禁止打开样品室。二、使用自检结束后(7个项目均出现ok字样)，仪器进入主菜单，屏幕显示如下七个功能项：1.光度测量;2.光谱测量;3.定量测量;4.动力学测量;5.数据处理;6.多波长测定;7.系统状态设定。仪器经30min热稳定后，就可以进入正常测量。1.光度测量 测定一定波长下的透光率(t%)或吸光度值(a)在主菜单中选中光度测量项后，按enter键进入此功能块 按goto wl键进入波长设置用数字键输入你所需的波长值 按enter键确认 屏幕提示：请稍等，仪器自动将波长移动到你所需测定的波长值 按f1键，选择测定透光率(t%)或吸光度值(a) 打开样品室盖，将空白溶液和待测样品分布放置比色皿架r位和s1位，关上样品室盖 按f3键，仪器自动将比色皿架r位置移动到光路中(即空白溶液)，屏幕上显示cell=r 按auto zero键，仪器自动对空白溶液调零。屏幕提示：请稍等 按f2键，比色皿架移动到s1位 (待测样品),屏幕上显示cell=s1 按f4键测量t%或a值测量完成后1)打印输出数据，按start/stop键2)返回主菜单，按mode键2. 光谱测量 波长扫描或光谱扫描，可直接测定一段波长范围内的光谱图和峰值谷值数据在主菜单中选中光谱测量项后，按enter键进入此功能块 根据需要设定测量模式、扫描范围、记录范围、扫描速度、采样间隔、扫描次数、显示模式各参数。按、方向键到达设定行，进行参数的修改，并按enter键确认 打开样品室盖，将空白溶液和待测样品分布放置比色皿架r位和s1位，关上样品室盖 按f3键，仪器自动将比色皿架r位置移动到光路中(即空白溶液)，屏幕上显示cell=r 按f1键进行基线校正。屏幕提示：基线校正 按f2键，比色皿架移动到s1位 (待测样品),屏幕上显示cell=s1 按start/stop键开始光谱扫描 屏幕显示扫描图谱扫描结束后1)打印结果谱图，按f4键2)直接读取峰谷值，按f2键，屏幕显示“请输入峰/谷检测灵敏度”(默认值为3)，按enter键确认3)存储图谱，获取整个波长范围内的数据，按f3键，用、方向键选择10个数字和26个字母组成文件名，按enter键确认，按f4存储，按1-8数字键确定文件序列号4)修改谱图坐标范围，按f1键。修改完毕后，按start/stop键确认后，谱图将按新设定坐标被刷新5)返回上一级菜单，按mode键3. 定量测定 建立浓度曲线，直接测定样品的浓度主菜单中选中定量测定项后，按enter键进入此功能块 根据需要设定测量波长、测量单位、测量方法各参数。按、方向键到达设定行，进行参数的修改，并按enter键确认3.1 k系数法已知斜率k和截距b，测出样品的吸光度值后待入公式就可算出浓度值在测量方法中选择k系数法，并按enter键确认 按f2键，将k值和b值输入，按enter键确认 打开样品室盖，在当前光路的比色皿架位中放入空白样品，关上样品室盖 按auto zero键调零 将样品放入比色皿架中 按start/stop键进入数据测量界面 按f2键移动比色皿架，使被测样品处于光路中 按start/stop键测量3.2单点标定法测量一个标准样品的吸光度与坐标零点建立工作曲线，测定未知样品浓度在测量方法中选择单点标定法，并按enter键确认 按f2键修改单点 按数字键输入标准样品的浓度值 按enter键 打开样品室盖，在当前光路的比色皿架位中放入空白样品，关上样品室盖 按auto zero键调零 将空白样品换成标准样品 按start/stop键测量标样的吸光度并显示 将样品放入比色皿架中 按start/stop键进入样品测量界面 按f2键移动比色皿架，使被测样品处于光路中 按start/stop键测量3.3多点标定法测量已知浓度的一系列标准样品吸光度，建立工作曲线来测定未知浓度在测量方法中选择多点标定法，并按enter键确认 打开样品室盖，在当前光路的比色皿架位中放入空白样品，关上样品室盖 按auto zero键调零 按f2键重新标定 按数字键输入标准样品数 按enter键确认 将标准样品依次放入比色皿架r、s1、s2位关上样品室盖 按f3移动比色皿架r位到光路 按enter键确认 按数字键输入标样浓度值，按enter键确认 按start/stop键测量标样的吸光度 按enter键确认 按f2键移样品位s1到光路，同样的方法测量所有标样的吸光度 按f1键生成方程曲线，显示该曲线的斜率k、截距b、相关系数r 按mode键返回定量测量菜单 按start/stop键进入数据测量菜单 放入样品 按f2键移动比色皿架，使被测样品处于光路中 按start/stop键测量6.多波长测定 同时测定几个波长下的透光率(t%)或吸光度值(a)主菜单中选中多波长测定项后，按enter键进入此功能块 按f3键设定测量波长数目和样品池个数，按enter键确定 按数字键输入相应波长值 打开样品室盖，将空白溶液和待测样品分布放置比色皿架r、s1、s2位，关上样品室盖 按start/stop键开始测量测量完成后1)打印输出数据，按f4键2)返回主菜单，按mode键三、关机将比色皿中的溶液倒尽，然后用蒸馏水或有机溶剂冲洗比色皿至干净，倒立晾干。关电源将干燥剂放入样品室内，盖上防尘罩，做好使用登记，得到管理老师认可方可离开。注意事项：1.开机前将样品室内的干燥剂取出，仪器自检过程中禁止打开样品室盖。2.比色皿内溶液以皿高的2/34/5为宜，不可过满以防液体溢出腐蚀仪器。测定时应保持比色皿清洁，池壁上液滴应用擦镜纸擦干，切勿用手捏透光面。测定紫外波长时，需选用石英比色皿。3.测定时，禁止将试剂或液体物质放在仪器的表面上，如有溶液溢出或其它原因将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净。4.实验结束后将比色皿中的溶液倒尽，然后用蒸馏水或有机溶剂冲洗比色皿至干净，倒立晾干。关电源将干燥剂放入样品室内，盖上防尘罩，做好使用登记，得到管理老师认可方可离开。问题处理：1、如果仪器不能初始化，关机重启;如不成功，请向管理老师反映。2、如果吸收值异常，依次检查：波长设置是否正确(重新调整波长，并重新调零)、测量时是否调零(如被误操作，重新调零)、比色皿是否用错(测定紫外波段时，要用石英比色皿)、样品准备是否有误(如有误，重新准备样品)。紫外分光光度计*校正方法1.波长 的 准确度 试验 以仪 器 显 示的 波长 数 值与 单 色 光的 实际 波 长值 之 间误 差表示，应在1.0nm 范围内。可用仪器中氘灯的 486.02nm 与 656.10nm 谱线进行 校正。2.吸收度的准确度试验3.杂散光的试验4.波长重现性试验5.分辨率试验紫外分光光度计*注意事项1.仪器工作电压一般为220V, 允许 10% 的电压波动。为保持 光源灯和检测系统的稳定性, 在电源电压波动较大的实验室最好配备稳压器。2.一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.20.8之间的误差较小。郎伯-比尔定律 只适用于稀溶液,太大了，A-C曲线已经偏离了直线性，越大弯曲越严重，需要稀释样品。3.拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。4.测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色 溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测 定，以减小测量误差。5.清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污， 可用盐酸-乙醇混合洗涤液(12)浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化 性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。6.每次做完实验时，应立即洗净比色皿。比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水 纸吸干，以保护透光面。晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。7.仪器的光栅、反射镜绝对不能擦拭，否则将损坏仪器光学表面，增加杂散光。8.为了延长光源使用寿命, 在不用时不用开光源灯。如果光源 灯亮度明显减弱或不稳定, 应及时更换新灯。更换后要调节好灯丝位置, 不要用手直接接触窗口或灯泡, 避免油污沾附, 若不小心接触过, 要用无水乙醇以擦拭。9.单色器是仪器的核心部分, 装在密封盒内, 不能 拆开, 为防止色散元件受潮发霉, 必须经常更换干燥剂。10.必须正确使用吸收池, 保护吸收池光学面11.光电转换元件不能长时间曝光, 应避免强光照射或受潮积尘。紫外分光光度计*保养和维护方法1.为了延长光源的使用寿命，在使用时应尽量减 少开关次数，短时间工作间隔内可以不关灯。 刚关闭的光源灯不要立即重新开启。如果光源灯亮度明显减弱或不稳定，应及时更换新灯。2.要经常更换单色器盒的干燥剂，防止色散元件受潮生霉。仪器停用期间，应在样品室和塑料仪器罩内放置防潮硅胶，以免受潮，使反射镜 面有霉点及沾污。同时选择波长应平衡地转动， 不可用力过猛。3.正确使用吸收池，保护吸收池光学面。不能将光学面与手指、硬物或脏 物接触，只能用擦镜纸或丝绸擦拭光学面;不得在火焰或电炉上进行加 热或烘烤吸收池。生物样品、胶体或其他在池体上易形成薄膜的物质要用适当的溶剂洗涤;有色物质污染，可用3mol/lHCL和等体积乙醇的混合液洗涤。4.电压波动较大时，要配备有过压保护的稳压器。5. 停止工作时，必须切断电源，盖上防尘罩。仪器若长期不用要定期通电 2030分钟。6.首先在使用仪器前必须认真阅读仪器说明书用户应当了解仪器的校正法如波长精度的校正光源灯的调整等在仪器使用说明书中都有详细介绍仪器说明书应当妥善保存以便随时查阅。7.仪器必须设专人保管使用使用者应热知仪器各旋按键的功能和作用仪器使用前必须预热5-30分钟,预热时除打开总电源开关和所选用的光源开关外应,同时将挡光杆退出光路使光电倍增管得到光照并调粗调旋钮使数字电压表在量 程旋钮置肠档时显示接近100.0,这样光电倍增管及负高压 控制系统都进入预热状态,使卞时更加稳定8.预热完毕,仪器进入使用状态,将档光杆推入光路,数字电压表应显示0.00.否则可调仪器右侧卜方调零旋钮,使 数字电压表显示0.00允许误差为末位士2个字,然后将 “参比”置于光路,调节粗调细调旋钮,使数宇电压表显 示100.0,再将量程开关100百分之T档转换到0-2A档，数字电压表应显示0.000，允许误差为士0.002.9.如测试数据重复性不好，即同一样由于某种原因使仪器外壳带电，给人身和仪器带来危害10.对仪器工作环境的要求分光光度计应安装在稳定的工作台上, ( 周围不应有强磁场, 以防电磁干扰) ,