五种商品化肺炎支原体试剂的比较.doc

Ann Biol Clin（1992） 50.593-597 Elsevier. Paris 原文五种商品化试剂盒评估：补体结合试验、微型颗粒凝集试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫试验和乳胶凝集试验，与免疫印迹法比较肺炎支原体血清学G Aubert，B Pozzetto，OG Gaudin，J HafidAD Mbida，A Ros法国Cedex2，Saint-Etienne 42032，ruc Ambroise-Pare 15Saint-Etienne大学Jacques-Lisfranc医学系 细菌学及病毒学实验室（稿至日期：1992年2月10日；接受日期：1992年6月10日）摘要：一组68份血清样品采集自41个试验志愿者。当用免疫印迹法检测180kDa蛋白时，这些试验志愿者显示出不同的肺炎支原体免疫学图象。本研究使用这68份样品来评估5种商品化试验，这5种试验分别基于不同的方法：补体结合试验（CFT）、微型颗粒凝集法（MAG）、间接免疫荧光法（IFA）、酶联免疫法（ELISA）和乳胶凝集法（LA）。这些试验都分别按照各自的生产商提供的使用说明书进行操作。对于肺炎支原体的免疫性判定来说，5种试验都与免疫印迹法相符得很好：5种试验的敏感性均为100%。特异性从95.6%（MAG）到82.6%（ELISA）不等，总体符合率从98.2%（MAG）到92.8%（ELISA）不等。比较4种定量试验（CFT、MAG、IFA和ELISA）抗体滴度，得到的相关系数从0.87（CFT-IFA）至0.67（CFT-ELISA）不等。免疫印迹法图象所显示6例显著抗体升高，除了有一例未被ELISA方法检出外，其它均被所有试验检出。总体而言，在对肺炎支原体免疫状态的常规判定中，这些商品化试剂盒能提供令人满意的结果：其中CFT最便宜，而MAG和LA最易于操作。肺炎支原体 / 血清学 / 免疫印迹法 / 抗体简介肺炎支原体是一种常见的人类病原体，引起广谱的疾病，包括呼吸道和呼吸道外症状，即神经性感染，有可能造成生命危险1，2。培养肺炎支原体是一项繁琐而费时的工作，而通过杂交3，7和聚合酶链式反应8来检测细菌基因组虽然是非常有希望的方法，但现在还处于开发阶段。因此，对肺炎支原体感染的生物学诊断仍然要以血清学方法为主。虽然补体结合试验（CFT）是最常用的常规试验，但是还有大量的方法可以使用，例如补体介导杀伤试验10、放射免疫沉淀试验11、间接红细胞凝集（IFA）14，酶联免疫试验（ELISA）15-17和粘着抑制试验18。其中一些已开发出商品化试剂盒。有证据显示一种分子量为160190kDa（在我们这里是180kDa）的肺炎支原体表面蛋白（起到粘素的作用）在肺炎支原体感染患者体内会连续激发特异性抗体的生成。它是免疫印迹法21，22和ELISA方法21，23，24的判定对象。参考免疫印迹法对该蛋白的检出结果，我们对5种商品化试剂盒进行了评估。评估中共使用了来自41个试验志愿者的一组68份血清样品，这些试验志愿者显示出不同的肺炎支原体免疫学图象。材料和方法试验志愿者和血清来自41个试验志愿者的68份血清样品（15岁以下儿童34个；成年人7个；女性18个；男性23个。平均年龄：9.5岁。年龄范围：10个月50岁）是基于不同的肺炎支原体免疫学图象回顾性选出的，而肺炎支原体免疫学图象是按照免疫印迹法p180检测结果得出的。血清样品被分成3组：1）来自17个人的33份p180阳性血清（在该组中，当同一个患者有多份/26份血清接受检测时，p180印迹图象强度大体上相同）；2）来自18个人的23份p180阴性血清；3）来自6位患者的12份成对血清，它们的免疫印迹p180带强度有显著变化：4位患者从无到有；2位患者从弱到强。这6例情况被认为是出现了肺炎支原体血清转化现象。免疫印迹法 37在SP4培养基25上培养肺炎支原体C200株7天。在PBS中洗3次并且进行了超声波降解后，使用不连续Laemmli系统26在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离最终抗原。按照Towbin技术27，将该蛋白从凝胶上电转移到聚偏二氟乙烯薄膜（美国Millipore公司ImmobilonR）上。转移后，将膜切成34mm宽的条，在纯甲醇中浸泡几秒钟，然后在含有5%（w/v）撇脂牛奶的10mM Tris盐水缓冲液中37预温育1小时。将这些印迹与用同样缓冲液1:10稀释过的血清样品在37混合温育3小时，接着用10mM Tris盐水洗6次，然后用含0.5%（w/v）撇脂牛奶的10mM Tris盐水缓冲液1:500稀释过的过氧化物酶标记兔抗人IgG（法国Dakopatts公司生产）一起混合温育。如上述方法再洗一次后，加入过氧化物酶底物（含0.3%（w/v）4-氯-1-萘酚、0.003%（w/v）过氧化氢的Tris盐水）几分钟后，观察颜色反应。在本研究中，注意力应该主要集中在p180带上，通过目视判定读数：阴性、阳性+、+和+。按照生产商提供的使用说明书操作五种商品化试验。补体结合试验（CFT）CFT是用商品化的糖脂肺炎支原体抗原（德国Marburg市Behring学院公司生产）在含有两单位豚鼠补体的U型反应板28中进行微量反应的方法。用两个对倍步骤（从1:81:64）或更多对倍步骤稀释血清样品。补体结合试验滴度为8或更大被判定为肺炎支原体抗体反应显著。微型颗粒凝集试验（MAG）MAG试剂盒（赛乐迪亚-麦可II）购自富士瑞必欧公司（法国Epernon的Miles）。用肺炎支原体细胞膜成分致敏的人造明胶颗粒与相同体积的热灭活（5630分钟）血清样品在U型微量反应板内混合。血清样品从1:40至1:640对倍稀释两次或更多（最多到1:20480）。室温下温育3小时后目视判读凝集滴度。生产商建议将40或更高的MAG滴度判定为肺炎支原体免疫应答显著。间接免疫荧光试验（IFA）IFA载片购自Zeus技术公司（法国Domont的技术诊断公司）：加入25l的1:64和1:256倍稀释的血清样品，在潮湿室中室温放置30分钟。在PBS中洗5分钟。用荧光素异硫氰酸盐标记的抗人类球蛋白与载片混合温育30分钟，温育条件同上。接着洗片。然后用甘油缓冲液固定，用Leitz荧光显微镜放大400倍检查。滴度在256以上的血清样品再检测到1024。按照试剂盒提供者的建议，IFA滴度为64或更高时判定为肺炎支原体免疫应答显著。酶联免疫试验（ELISA）250l的1:25稀释血清样品被加入到包被有肺炎支原体抗原或对照抗原（Platelia支原体，参考号62760，法国Marnes-la-Coquette的诊断巴斯德公司生产）的微量反应板的孔中，在室温下静置45分钟。用PBS-Tween洗4次后，每孔加入250l已稀释碱性磷酸酶偶联抗人IgG兔球蛋白，在室温下温育45分钟。然后同上方法洗板。接着在室温下与碱性磷酸酶底物（用二乙醇胺缓冲液稀释过的对硝基苯磷酸）（每孔250l）反应45分钟。每孔加入50l浓度为1N的氢氧化钠以便终止反应。在Multiscan分光光度计中以405nm波长读数（法国Asnieres的Flow实验室公司生产）。生产商建议：使用标准曲线计算ELISA值：ELISA值超过0.16的血清样品判定为肺炎支原体免疫应答显著。乳胶凝集试验（LA）25l稀释倍数为1:10血清样品用相同体积的肺炎支原体致敏乳胶混合（法国DBV的肺炎支原体Serofast公司生产）在3分钟内判读凝集图象。该技术仅记录定性结果（凝集：、；或不凝集）。结果56份血清样品（不包括12份出现血清转化的成对血清在内的总计份数）被用于评估商品化试验判定肺炎支原体免疫状态的能力，参考方法为p180免疫印迹法。如表I所示，没有一种方法对33份p180抗体阳性血清显示阴性结果，因此敏感性都很优秀。特异性范围则从82.6%（ELISA）到95.6%（MAG）。在23份p180抗体阴性血清中有4份血清用五种商品化试验的其中之一得到阳性结果：来自同一患者的2份血清在4种试验（CFT、IFA、ELISA和LA）中为阳性，但在MAG和免疫印迹法中为阴性；一份样品是IFA、ELISA和MAG阳性，但在其它方法中为阴性。一份样品仅为ELISA阳性。五种试验与参考方法即免疫印迹法的总体符合率都超过了90%（参见表I）。用四种半定量试验（CFT、IFA、MAG和ELISA）对全部68份血清样品中的特异性抗体量进行比较性评估。前面3种技术用抗体滴度进行计算，ELISA用任意单位进行计算。如图I所示，CFT、IFA和MAG的定量结果相关性好，相关系数为0.84或更高。在ELISA值和CFT或MAG滴度之间的相关性就要弱一些（相关系数r分别为0.67和0.69。参见图I）。需要特别注意6位患者的血清学结果，这6位患者的成对血清用免疫印迹法检测出现血清转化现象。表II中汇总了这些数据。用抗体滴度表示结果的3种技术（CFT、IFA、MAG），全都显示出显著的上升。与之相似的是，在使用LA检测时6例中都观察到了定性的变化。但是，ELISA方法即使进行重复试验也不能清晰地检出4号患者（表II）的血清转化，而其它5种技术都能清晰地判定出来。当对6种技术进行比较时，发现急性期血清样品显示出非常不同的图象：例如，来自2号患者的急性期血清为印迹、CFT和MAG阴性而其它试验阳性。来自5号患者的急性期血清为印迹、ELISA和MAG阳性而其它试验阴性。这些分歧可能与特异性抗体出现的动力学有关，其变异很大，从一位患者到另一位或到过去感染形成的前在抗体。讨论该项研究被设计用来评估5种商品化技术判定血清对肺炎支原体的免疫状态的能力，参考技术是p180免疫印迹法。其中4种技术（CFT、MAG、IFA和LA）能够检测抗肺炎支原体IgM和IgG两种抗体，而ELISA只能检测IgG一种抗体。五种试验都显示出卓越的敏感性和令人满意的特异性。不过ELISA相对而言特异性较低（82.6%），并且在以前进行的其它两次比较研究（比较CFT和ELISA）中也报道过这种事实，其中第二次所用的ELISA试剂与我们所用的相同。正如以前研究所暗示的那样，这种较低的特异性可能与和其它支原体菌种的交叉反应有关。至于抗体定量方面，CFT、IFA和MAG显示出良好的相关性（图I）。在一次同样比较这些技术的研究中32，作者也注意到这3种技术之间的良好相关性，并且ELISA结果又一次显示出与CFT和MAG滴度的分歧。在可行性方面，LA试验看起来是操作最简便的方法，推荐用于大批样本的免疫学筛查。如果需要进行定量试验，MAG是一种良好的替代方法，即使没有必要如本研究一样判定终点滴度也是如此，滴度为160或更高时被推断为新近感染32，33。近来的研究确认MAG能够从三种免疫球蛋白IgM、IgG和IgA34检测出肺炎支原体特异性抗体34。以我们的经验来看，如果只考虑价格因素，CFT是最便宜的试验，而IFA和ELISA则贵一些。另外，虽然研究的目的不是评估5种方法在诊断新近感染方面的价值，但是我们评估了它们检出6对血清样品（它们在IgG印迹中都显示抗体升高）血清转化的能力。我们知道在我们检测的血清样品中有少量的血清转化血清样品并且缺少对IFA、ELISA32、35、36和印迹法22的IgM试验评估32。相应的，我们关于6种被试方法中的5种在检测成对血清方面具有满意的一致性的结论仅仅表明了它们在诊断肺炎支原体新近感染方面是有价值的。6例血清转化中有1例未能被ELISA检出，这与Uldm等人30关于这种试验在诊断方面只具有有限价值的观点是一致的。在本研究中，我们决定将免疫印迹法作为评估其它5种肺炎支原体血清学方法的参考方法：总的来说，5种试验与p180IgG免疫印迹法在日常判定肺炎支原体免疫状态方面具有良好的一致性。致谢我们对于技术诊断公司（免疫荧光检测）、Miles公司（微粒凝集法）和诊断巴斯德公司（ELISA）向本项研究馈赠了一些商品化试剂表示感谢。表I：以p180免疫印迹法作为参考方法，对5种商品化试验在判定56份血清样品肺炎支原体免疫状态方面的能力进行比较。P180/其它方法血清份数aCFTIFAELISAMAGLA+/+3333333333-/-2120192221+/-00000-/+23412总体一致率（%）96.494.692.898.296.4敏感性（%）100100100100100特异性（%）91.387.082.695.691.3a 各试验阳性率的定义参见材料与方法。表II：免疫印迹图象出现显著变化的6对血清样品的血清学检测结果商品化试验患者号（性别/年龄）日期月/日印迹p180aCFTbIFAbELISAMAGbLA值比率c1（M/3）1/081/250+832641280.010.2727401280-+2（M/4）10/1612/170+832645120.210.412405120+3（M/4）